“影响酶活性的条件”的拓展实验

唐红梅

摘要 溶菌酶在鸡蛋清中的含量较为丰富，可以用较为简易的方法制备。溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的3-1，4糖苷键。测定溶菌酶活力时，可用溶壁微球菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活性的高低。通过紫外分光光度计可以直观呈现酶活性变化，因酶活不同，A450nm的OD450 run值变化就不同。

关键词 溶茵酶 溶壁微球菌细胞壁 紫外分光光度计

中图分类号Q-331

文献标志码B

人教版高中生物教材《必修1.分子与细胞》第五章第二节的探究实验“影响酶活性的条件”要求学生根据教材所给的材料和试剂独立设计实验，来探究温度与pH条件对两种酶活性的影响。考虑到中学生的实验水平以及中学实验室的实际情况等因素，专家们在活动方案中建议使用淀粉酶探究温度对酶活性的影响，使用过氧化氢酶探究pH对酶活性的影响。有教师采用了由学生自己从绿豆中提取的酶在淀粉琼脂培养基上，用圆形滤纸片浸在不同的介质中，用碘液检验淀粉被分解的状况来反映酶活性。有教师利用注射器对实验装置和实验方法进行优化改进，并利用信息技术手段，实现师生之间有效的互动，使探究课落到实处的。有教师利用分光光度计创设实验条件，并以问题串的方式引导学生设计实验，学生通过探究影响酶活性的实验，得到真实数据并转换成曲线，完成建模。有教师在“温度对酶活性的影响”实验过程中借助了固体培养基及透明圈等大学微生物常用的酶活粗检方法，创新实验过程和观察方法的。这些做法对于开拓学生视野、提高他们的科学素养和创新意识都具有重要意义。

但是用淀粉酶探究温度对酶活性的影响，如果在较高温度下加入碘液，又看不到变蓝的现象。实际上“影响酶活性的实验”从实验设计上难度不大，学生利用所掌握的实验设计方法，在教师的引导下完全可以根据实验原理和要求，因地制宜地选用本地的经济实惠的实验材料，或者说基于易于操作、实验现象明显的原则，自己设出实验方案。例如，教师可以提议学生用木瓜乳汁制备木瓜蛋白酶，摸索使切成薄片的鸡蛋白消失的酶液浓度和所需时间;尝试用自制的鸡蛋清溶菌酶水解溶壁微球菌测定酶活力的变化……这些实验可以使学生认识到探究实验和材料选择具有多样性，可以在实践中基于需要进行材料、装置或者试剂进行优化和改进。因此，建议教师组织有兴趣的学生开展课外拓展活动，发挥学生在学习中的主动性和创造性。

1 实验原理

溶菌酶广泛存在于动物、植物和微生物中，以鸡蛋清中的含量较为丰富。溶菌酶能催化水解细菌细胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的3-1，4糖苷键。

测定溶菌酶活力时，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活性的高低。酶活性越高，A450 nm的变化越快，反之越慢。

不同的温度和pH可以改变酶的活性。

2 实验材料及仪器

溶壁微球菌，紫外分光光度计。

3 实验步骤

（1）取溶壁微球菌15 mg，加入pH6.2、物质量浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲液2 mL，研磨成匀浆，定容至100 mL，配成OD450nm为0.6-0.7的悬浮液，于30℃保温。

（2）制备鸡蛋清溶菌酶：选择蛋清的pH大于8.0的新鲜鸡蛋，清洁鸡蛋表面，蛋壳两端敲洞取蛋清。轻轻搅匀蛋清，搅拌过程中避免起泡，以免影响溶菌酶活性及产率。双层尼龙布过滤蛋清，滤去脐带与蛋壳。按每升鸡蛋清加入50 gNaCI的比例加盐盐析，置于冰上边加边搅拌。用1M的NaOH溶液调节pH为9.5-10.0，边加边搅拌，于4℃下静止过夜至结晶析出。结晶过滤或离心，用丙酮洗涤结晶3次，常温干燥。

（3）不同pH处理鸡蛋清溶菌酶：将鸡蛋清溶菌酶在室温（25℃）下分别放在pH为4.5、6.5、8.5的的磷酸盐缓冲溶液中0.5 h。不同温度处理鸡蛋清溶菌酶：将鸡蛋清溶菌酶在pH为6.2的相同磷酸盐缓冲液中，分别在25、65、10cC不同温度下放置0.5 h。

（4）吸取2.5 mL己配置好的溶液至比色杯，加入0.1 mL鸡蛋清溶菌酶酶液（预先用不同温度或pH处理过），测定2 min内A450 nm的变化（以0.1 mol/L磷酸缓冲液调零点），每30s记录一次读数。

（5）比较不同处理的各时段OD450 nm的变化值。

4 该实验的优点

不再使用猪肝实验材料，同时也减少了实验操作过程中加棉花塞试管的麻烦;试剂的使用量少;实验可操作性强，花时少，误差小，可重复性强;形象直观地呈现出酶活性的高低变化。

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