泡菜“花变”初期主要细菌的分离与鉴定

左若弘 （南京市第十三中学 江苏南京 210000）

泡菜以清脆、开胃、滋味爽口著称，在中国已有大约3000多年的历史。泡菜是以新鲜蔬菜为原料，利用自身附着的微生物或添加的乳酸菌作为发酵剂，通过厌氧发酵所制成的传统而独特的发酵食品。蔬菜表面通常附生有细菌、酵母菌和霉菌等多种微生物，在泡菜的制作过程中乳酸菌最终成为优势菌，其代谢产物和低氧分的环境抑制了食品腐败菌的生长，从而保障了食品的品质和风味。

家庭制作泡菜简单易行，食用方便。但由于泡菜原料未经过灭菌处理，因此在后期发酵过程中一旦环境温度升高或者存放条件不利，泡菜中的腐败微生物就会大量滋生，从而导致产品的腐败变质。在泡菜品质劣变的众多显现中，“生花”是最常见的现象之一。“生花”就是在泡菜表面形成一层白膜，泡菜一旦生花之后，菜品风味发生不期待的变化（馊臭味或腐败味），泡菜坛中盐水表面形成白色成片或成碎花状的膜，菜品开始软烂，泡菜水变浑浊，轻者影响风味，重者整坛菜都不能食用。在夏秋季节由于温度较高，在家庭制作的泡菜中约90%会出现不同程度的生花现象。

本实验欲从引起泡菜生花的微生物入手，对其进行分离、回接，从而明确引起泡菜腐败的主要微生物类群，通过生物防控的方式控制这些腐败微生物的生长，从而开发出富含活性益生菌的安全、卫生的泡菜产品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：从笔者家庭制作的泡菜里收集自然发酵的、存放时间较长，泡菜汁正在变得浑浊但还没有明显“生花”的泡菜汁1份。

牛肉蛋白胨培养基、乳酸细菌培养基（MRS培养基）、溶菌酶、蛋白酶K、由生物公司合成的细菌16S rDNA序列扩增引物（R1：5′-CGGTTACCTTGTTAC⁃GACTT-3′、R2：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）。

仪器：光学显微镜、PCR扩增仪、凝胶成像系统。

1.2 实验方法

1.2.1 泡菜汁中细菌的分离

泡菜汁活化→10倍法稀释涂布含有0.75%质量分数为CaCO3的MRS平板→挑起有溶钙圈的单菌落染色、镜检→在37℃固体划线培养，选出溶钙圈大、生长速度快的纯培养，液体培养选择产酸速度较快、产酸量大的菌株。

1.2.2 初步鉴定

（1）载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

（2）草酸铵结晶紫染1min，自来水冲洗，去掉浮色。（3）用碘-碘化钾溶液媒染1 min，倾去多余溶液。（4）用中性脱色剂如乙醇（体积分数为95%）或丙酮酸脱色30 s，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

（5）用番红染液或者沙黄复染30 s，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

（6）用光学显微镜观察。

1.2.3 16S rDNA序列扩增

16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80%），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。16S rDNA由于大小适中，约1.5 kb，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。目前，16S rDNA的序列信息已经广泛应用于菌种鉴定和系统发生学研究。

（1）DNA提取。挑取单菌落接种于5 mL的MRS液体培养基，37℃厌氧培养48 h，取部分获得纯培养物加15%灭菌甘油-70℃保存菌种，其余培养液置于4℃冰箱静置2 h后，吸取1.5 mL菌体置于离心管中，8 000 r/min离心5 min，去上清液;沉淀用灭菌生理盐水洗涤2次，加入200 μL溶菌酶（ 50 mg/mL）混匀，37℃放置2h，8000r/min离心5min，去上清液;沉淀用灭菌生理盐水洗涤2次，加入200μL溶菌酶（50mg/mL）混匀，37℃放置2 h;加入400 μL 10%SDS 混匀，再加入 5 μL 蛋白酶K（20 mg/mL），55℃水浴1 h;加入650 μL 酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）抽提，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液至1.5 mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，12 000 r/min离心10 min，沉淀用70%乙醇洗涤一次，室温吹干后加入25 μL的TE缓冲液溶解，取8 μL DNA提取物用1%的琼脂糖电泳检测，其余样品-20℃贮存备用。

（2）菌株16S核糖体DNA的PCR扩增。检测反应体系为：50 ng/μL DNA 模板3 μL，RS上游引物和下游引物（50 pmol/μL）各2 μL，10 × PCR 缓冲液5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，Taq酶1 μL，2 mmol/LMgCl22 μL，ddH2O 33 μL;PCR 扩增程序为94℃预变性4 min，94℃变性1 min;52℃退火1 min;72℃延伸2 min，30个循环;72℃补充延伸10 min后反应结束。每个样品扩增2次。取10 μL PCR扩增产物和2 μL溴酚蓝混合，以70 V电压在1.5%琼脂糖上电泳2 h，溴化乙锭染色20 min，用凝胶成像系统拍照并记录结果。

（3）菌株16S rDNA的测序分析。PCR检测反应体系中16S rDNA上游引物和下游引物（50 pmol/μL）各2 μL，其余组分同上;PCR扩增程序为94℃预变性4 min，94℃变性1 min;55℃退火45 s;72℃延伸2 min，35个循环;72℃补充延伸10 min后反应结束。取10 μL PCR扩增产物在1.0%琼脂糖上电泳检测条带大小，其余产物送上海生物工程技术服务有限公司测序分析，序列测定结果登陆NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），将所得序列与数据库中已知序列进行同源性搜索比对。

2 结果与分析

2.1 菌株培养

细菌分离培养所得菌落较小，直径0.2~0.5 mm，在培养基上略突起，圆点状，显白色偏黄，略透明，边缘明显，生长缓慢。

2.2 光学显微镜观察

经革兰氏染色后在40倍油镜下观察：菌株经革兰氏染色后呈红色，可见该菌为革兰氏阴性菌。形状为椭圆形，多集中在一起，大小各异，大者比小者大1倍。

2.3 16S rDNA基因PCR产物

采用即用型PCR扩增试剂盒对各菌株提取的基因组DNA进行PCR扩增，电泳结果显示扩增的DNA片段大小约为1 500 bp。

得到的各菌株16S rDNA基因序列全长1 508 bp。将该序列在NCBI（美国国家生物技术信息中心）网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上进行同源序列搜索，根据搜索结果，该菌株与解鸟氨酸拉乌尔菌（Raoultella ornithinolytica）B6的全基因组序列的16 S rDNA相似度高，相似度为97%。

3 结论与讨论

（1）首次报道了泡菜“花变”初期大量存在解鸟氨酸拉乌尔菌，并首次对其进行了形态观察。由于对其的繁殖方式未做研究，电镜观察到的该细菌不为二分裂繁殖，L型菌体似出芽繁殖，这有待进一步研究。

（2）细菌的鉴定方法。细菌的鉴定方法可以依靠直接形态观察和生理生化特征分析方法，但这两种方法不但耗时费力而且获取的信息也比较有限，而挑取代表菌株进行16S rDNA测序鉴定，可以快速准确地鉴定分析菌株。在以后的细菌鉴定研究中可以优先选择采用。

（3）解鸟氨酸拉乌尔菌为好氧菌，因此在泡菜花变初期，泡菜水开始浑浊之时，注意只要将泡菜水上方的氧气去掉，那么水体表面的杂菌就很难生存了。如何去氧就要看你的实际情况了。买一份除氧剂，想办法将其安置到泡菜坛里即可。民间的办法是用铁，铁易被氧化，将干净铁块直接投入泡菜水可以除氧，将铁粉或碎铁包好粘附在泡菜坛盖内顶，能除空气中的氧。但是，用铁有个不好就是吸氧后产生铁锈。因此，将铁块投入水内的做法只用来清除白花，清除完毕就要取出来。