SRAP标记的野生油茶种质遗传多样性研究

文 张涛 朱孝天 肖立宏 .安徽东旭大别山农业科技有限公司；.安徽农业大学

目的：研究野生油茶种质遗传的多样性。方法：选取分辨力较强、多态性较高的19对引物组合，利用相关序列扩增多态性分子标记技术（SPAP）对65份油茶种资源进行遗传多样性分析。结果：19对引物共扩增出281条带，多态性条带为238条，多态性频率为84.70%。此外，65份油茶种质资源间的遗传相似性变化范围在0.59-0.96之间，在经过聚类分析后发现，当相似系数为0.64时，可以将65份资源分为6个类群。结论：野生油茶种植物种之间具有较为丰富的遗传多样性，在油茶育种、保护方面有着十分重要的作用。

山茶科山茶属的油茶是我国特有的一种食用油本植物，其栽培的历程较长，大约有两千年之久。同时，它也是世界上四大木本油料植物之一。此外，这种油茶中含有较多的不饱和脂肪酸，这些都是人体极其需要的物质，这种油茶还有较高的营养价值、保健价值、药用价值。因此，对这种野生种植油茶的遗传多样性研究十分重要。

相关序列扩增多态性是一种基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的新型分子标记技术。对于这种技术而言，其稳定性相对较高，在油茶的SRAP-PCR体系建立与优化中应用较为广泛，在天然群体、优良无性系的遗传多样性、种质资源研究中较为常见。本文利用相关序列扩增多态性分子标记技术（SPAP）对65份野生油茶种质资源进行了分析，旨为充分利用和挖掘油茶种质资源提供参考依据，这对油茶品种的培育和栽培有重要作用。

1 .材料与方法

1.1 供试材料

选取具有代表性的65株野生油茶单株为实验材料。

1.2 CTAB法提取植物DNA

采用植物DNA的提取方法CTAB法提取油茶中的DNA，并使用稀释的方式将其稀释为100ng/μL，保存温度为-20℃。

1.3 SRAP扩增PCR反应体系

采用PTC-100PCR仪器来进行PCR扩增，并采用25μL反应体系：1.25μL引物（25ng/μL）、1.25μL模板DNA（100ng/μL）、12.5μLMix、ddH2O补足25μL。

反应程序：首先94℃5min继续94℃1min，35℃1min，72℃1.5min，5个循环，94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，循环35次后，72℃延伸7min，在4℃温度下保存。

1.4 筛选多态性引物组合

在筛选过程中，应选择扩增条带相对较好、重复性较高的143对SPAP引物来完成SPAP扩增。

1.5 数据分析

用“1”和“0”分别表示SRAP扩增谱的有和无，并用多态性计算所获取的数据；采用NTSYS-pc9（Version2.10e）计算相应的遗传相似系数和遗传距离；聚类图的建立要按照非加权平均法（unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA）进行建立。

2 .结果与分析

2.1 SRAP扩增分析

在143对引物中筛选出19对SRPA引物进行PCR扩增，筛选的扩增带需丰富，并且具有较高的清晰度。在进行相应的PCR扩增后，得到相应的扩增带，详见表1，并条带的大小范围在250-2000bp之间。其中，平均每条引物可以获得扩增条带为14.9条，多态性条带为238条，多态性频率为84.70%，详见表2。当引物为E1/M11和E4/M7时，扩增出的多态性条带为20条，相比较其他引物较多，如图1所示。当引物为E5/M7时，扩增出的多态性条带为8条，相比较其他引物较少。经过上述的分析表明：在经过SRAP标记后，其多态性相对较高、清晰度较好，在评价野生油茶种植资源多样性方面有十分重要的作用。

图1 以E4/M7为扩增引物的SRAP图谱

表1 用于野生油茶种质SRAP分析的引物序列

表2 SRAP的引物扩增条带统计

2.2 遗传多样性分析

物种之间的基因变化情况可以通过分析遗传多样性指标来确定。为了明确物种的起源以及预测物种的生长趋势，首先需对物种的遗传多样性进行相应的研究，这对物种的保存和培育有重要作用。

本次研究采用19对SRAP引物对65份野生油茶种质资源进行PCR扩增，在经过相应的扩增以后，得到其平均多肽频率，大约为84.70%。其中，有两对的多肽频率相对较高，高达100%。在对E2/M9、E3/M8、E12/M10进行扩增分析后发现，其多肽频率相对其它物种较低，发生这种情况的原因可能是与提供的材料有关。但是总体来说，SRAP在评价油渣资源的遗传多样性方面十分关键，其评价的准确性相对较高。对于一些差异相对较大的遗传多样性而言，其充分证明了本次研究具有相对较大的遗传变异性，为油茶资源的收集提供了重要的依据，对后续的油茶资源培育和杂交育种有重要作用。

2.3 65份油茶种质资源遗传相似性分析

就遗传相似性而言，其能够准确的判断出油茶物种之间的亲缘关系。在通过19对引物组合对65份油茶种质资源进行分析以后，发现其遗传相似性的变化范围在处于0.59-0.96之间。其中遗传相似性最高的达到0.96，说明两种材料之间的亲缘关系相对较近，而遗传相似性最低为0.59，说明两材料之间的亲缘关系相对较远。

2.4 遗传聚类分析

经上述研究结果表明：在进行的相应的PCR扩增试验后，发现野生油茶的遗传相似性似系数位于0.59-0.96范围内。其中，在系数为0.64时，可将其分为6各种群。此时，来自同一区域A的野生油茶主要是聚集在Ⅰ类种群中；来自区域B的野生油茶分别集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ类种群；C区域的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ类种群中，区域D的野生油茶集中在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ类种群中。经过相应的研究表明，区域A、B中的野生油茶遗传多样性相比较C、D较低，但是却具有较高的亲缘关系。

3 .讨论

本次研究选取分辨力较强、多态性较高的19对引物组合，利用相关序列扩增多态性分子标记技术（SPAP）对65份油茶种资源进行扩增。在进行扩增以后，得到的多态性条带较为丰富，并且清晰度和重复性较高，这充分说明了野生油茶种质资源的遗传多样性比较丰富，并且容易育种和进行遗传改良。在进行聚类分析后，发现野生油茶的遗传相似性系数在0.59-0.96范围内，聚类结果充分说明了野生油茶样品之间存在相应的遗传差异性。此外，从分析结果中可以看出，当植株属于同一类群时，植株可能是来源于相同的区域中，也有可能是来自不同区域中，此种结果充分表明了野生油茶聚类分析并没有考虑到植株的来源地，导致植株的亲缘关系具有一定的复杂性。产生这种情况的原因主要有以下几点：（1）不同植株之间进行授粉、偶然的基因突变、在长期的自然条件下，油茶为了更好的适应环境，因此具有了多样性的特征；（2）一部分的样品没有根据其地理区域进行聚合，这可能是由于油茶自然分化时地理区域的影响小于遗传漂移数量不均导致聚类结果不够均匀。

综上所述，本次研究选取的野生油茶种质资源生产区域气候比较适合油茶的生长。但是在品种混乱以及粗放式管理的经营模式下，导致野生油茶的收益并不理想。因此，在未来的野生油茶育种和保护的过程中，需充分利用现有的野生油茶资源，并将其收入到资源库中，使得其选择基地规模变大。