PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用

余慧

迄今为止，食源性致病微生物引起的中毒事件屡屡发生，也一直是困扰世界各地的食品安全问题之一，这不仅与致病性微生物本身的特性有关，同时更与致病性微生物的检测方法相关。传统的致病性微生物检验步骤是前/增菌培养、分离纯化培养、形态学鉴定、生理生化鉴定及血清学鉴定，这个过程手续繁琐、需时较长、不能满足人们要求。此时，PCR（Polymerase Chain Reaction）技术以灵敏度高、特异性强和时效高等特点凸显其优势，为各种有针对性致病微生物快速检测提供了技术支持。本文将从近年来PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用来展开论述。

国内食源性致病微生物检测技术现状

目前，国内大部分标准采用的是传统方法，它是提供高重复性、国内外公认的方法，也是用于解决纠纷的标准方法，但其缺点也显而易见，近年来，商检行业标准率先采用PCR技术应用到食源性致病菌的检测中来，例如《SN/T1870- 2016出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法》采用的是实时荧光PCR技术；《GB4789.6- 2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》的国家强制性标准中首次明确应用到了PCR技术。这些标准的实施给外界释放出一个信号——PCR技术越来越广泛的在食源性致病菌中得到应用，也是未来食品微生物检测发展的主要趋势。

PCR技术在食源性致病微微生物检测中的应用

PCR技术。（1）PCR技术的原理、特点及应用。PCR技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR经过十多年的发展与应用，现已成为生命科学领域最常用的PCR技术之一。PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，针对性强，配备预先设定特定程序的PCR仪，操作简单，快捷、准确性高。蔡亦红等通过设计1对特异性引物，优化PCR扩增条件，建立了快速、稳定的检测福氏志贺菌的PCR方法，能够快速的实现对食品中的志贺菌的诊断和监控。

（2）多重PCR技术的原理、特点及应用。随着PCR技术的成熟运用，基于PCR技术的新方法不断创新并应用到食源性致病微生物的检测中。多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加上多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、试剂和操作过程与常规PCR技术相同。多重PCR技术可实现多种食源性致病微生物的同步检测或鉴定，大幅度提高检出率，比单一PCR技术更具高效性和经济性。徐晓可等针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）、纤维蛋白原结合蛋白基因（ClfA）为靶基因，设计筛选2对引物，建立并优化了检测食品中金黄色葡萄球菌的多重PCR体系。

（3）实时荧光定量PCR技术的原理、特点及应用。荧光定量PCR是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，指在PCR反应体系中加入荧光染料或具有荧光标记的特异性的探针，利用荧光信号积累实时监测整个反应过程，最后通过标准曲线对产物进行定量分析。与常规PCR技术相比，可以在单一反应体系中检测多个致病性微生物数量，它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。马凯等利用特异性的引物与探针对食品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌进行三重荧光定量PCR检测，分别能检测出这三种致病菌在食品中的含量。

（4）RT- PCR技术的原理、特点及应用。RT- PCR即反转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。张驰采用逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR），以细菌的RNA为检测靶标，利用RNA与细菌存活状态及数量的相关性，建立了普通逆转录PCR检测方法和实时荧光逆转录PCR检测方法， 能有效地将沙门氏菌与其他亲缘关系较近的肠杆菌科细菌区分开来。

展望

近年来，人们越来越重视食源性致病微生物的预防控制和监测，建立更高效、灵敏的微生物检测技术是保证食品安全的未来发展需求。目前，PCR技术广泛应用于食源性致病微生物的鉴定，随着各项技术的成熟，更多的研究更傾向于将基础技术、跨学科技术相结合应用，取得了事半功倍的效果，例如MPCRDHPLC技术、PCR- DGGE指纹分析技术、PCRELISA酶联免疫技术等的综合应用，克服外源DNA污染、假阳性等缺陷，这些技术有望成为未来食源性致病性微生物检测的主要手段。