反相高效液相色谱法检验饮料中人工合成色素

张琦惠 梁伟 刘庚

目的：对饮料中7种人工合成色素（柠檬黄、新红、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、赤藓红）进行高效液相色谱法（HPLC）分析。方法 用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，将样品制成水溶液，经Mono Tower C18（3μm×100mm）色谱柱分离后，以甲醇：乙醇铵溶液（0.02mol/L）进行梯度洗脱，流速为1.00ml/min，在检测波长为254nm条件下进行检测，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。结果：7种人工合成色素在1.00-20.00mg/L质量浓度范围内的线性关系较为良好（r>0.999），回收率为95%- 101%，相对标准差（RSD）0.1%- 0.4%。结论：高效液相色谱法操作简便，结果准确可靠，重复性好，可广泛应用于饮料人工合成色素的检测。

食品着色剂分为两类：人工合成色素和天然色素，两者相比，因人工合成色素的着色效果更佳，且成本较低，而被广泛应用于食品生产中。人工合成色素的主要原料包括有苯、甲苯、萘和苯胺等，经有机反应（磺化、硝化、卤化和偶氮化等）后制成色素，长期食用后会对人体健康造成严重的损害。GB 2760- 2011《食品添加剂使用卫生标准》中对食品添加剂的使用原则、允许使用的品种、使用范围和最大使用量或残留量进行了规定。目前，我国允许使用的人工合成色素包括有柠檬黄、新红、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、赤藓红和酸性红等。

目前，人工合成色素的检测方式主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法和毛细管电泳法等。此次研究根据GB5009.35- 2016《食品中合成色剂的测定》中的实验原理，利用高效液相色谱法对饮料中的人工合成色素（柠檬黄、新红、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、赤藓红）进行检测，为相关检测单位提供一定的参考依据。

材料和方法

仪器。Agilent 1260 高效液相色谱仪，二极管阵列检测器。

试剂。试剂与标准溶液：柠檬酸溶液（柠檬酸20g，加水至100ml，充分溶解）、甲醇-甲酸（6：4）溶液（甲醇60ml、甲酸40ml，）、无水乙醇-氨水-水（7：2：1）（无水乙醇70ml、氨水溶液20ml、水10ml）、乙酸铵溶液（乙酸铵1.54g，加水至1000ml）、PH=4与PH=6的水（水加柠檬酸溶液）。

人工合成色素标准溶液：柠檬黄1.00ml（国家标准物质中心1.00mg/ml）、新红1.00ml（北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司1.00mg/ml）、日落黄2.00ml（中国计量学研究院度0.50mg/ml）、苋菜红1.00ml（国家标准物质中心1.00mg/ml）、胭脂红2.00ml（中国计量学研究院0.50mg/ml）、亮蓝2.00ml（中国计量学研究院0.50mg/ml）、赤藓红2.00ml（国家标准物质中心0.50mg/ml）。

样品处理。称取20g样品，置于100ml烧杯中，碳酸饮料直接进行10分钟的超声脱气与在60℃水浴上脱气之后进行比较，发现结果没有太大出入，加入柠檬酸溶液调节pH值分别到2，4，6，然后加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少量水调成粥状，倒入试样溶液中，搅拌片刻，用G3垂融漏斗抽滤，经60℃PH=4的水洗涤5次后，用甲醇-甲酸混合溶液洗涤5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液洗涤5次（每次5ml），收集解析液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解定容至10ml，经滤膜0.45 mμ过滤后，进行HPLC检测。发现在此次实验中pH值在2或4或6时，所测的结果变化不大，故在此次实验用柠檬酸溶液调节pH时，对分析的结果影响不大。

液相色谱分析条件。色谱柱：Mono Tower C18（3μm×100mm）代替Agilent5（T）C18 4.6*250mm 5μm发现粒径的减少在检测波长：254nm、柱温：35℃、流速1.00ml/min、进样量5 lμ、检测器：二极管阵列检测器；时对于合成色素有了更好的分离效果及分析时间大范围的缩短；流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02mol/ l）；梯度如表1所示。

结果

方法的线性范围和检出限。将以上7种人工合成色素标准溶液在设定的色谱条件下检测，结果显示，在1.00- 20.0mg/L质量浓度范围内7种人工合成色素具有良好的线性关系，各色素的出峰时间、平均峰面积、检出限和RSD如表2所示。

回收率实验。同时取18份不含人工合成色素的样品，各10g，分成2组，分别添加一定量的柠檬黄、新红、日落黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝和赤藓红混合标准溶液，加标回收和精密度试验按1.5/1.6进行。结果显示人工合成色素的回收率为95% - 101%，相对标准差（RSD）为0.1%- 0.3%。

讨论

此次试验基于GB5009.35- 2016《食品中合成着色剂的测定》开展试验，实验过程中采用甲醇和0.02mol/L乙酸铵为流动相进行梯度洗脱，以达到人工合成色素分离的效果。同时，将检测波长设定为254nm、采用色谱柱 Mono Tower C18（3μm×100mm）时与其他檢测方法相比，HPLC具备操作简便、成本较低和回收率较高等优点，适用于饮料中人工合成色素的检测。同时如有阳性样品在无质谱的情况下进行光谱200nm- 800nm扫描，与对照光谱图进行比较、确定。