注射用蜂毒对热痛模型小鼠的痛阈和外周血P物质、β-内啡肽水平的影响

董泓　李振彬　王志强　高囡囡　王丽敏　郭栋梁

【摘 要】目的：探索注射用蜂毒（BVI）对热痛模型小鼠的镇痛作用及对外周血P物质（SP）、

β-内啡肽（β-EP）水平的影响。方法：选择合格昆明小鼠200只，随机分为BVI大剂量（BVI-H）组、BVI中剂量（BVI-M）组、BVI小剂量（BVI-L）组、吗啡组、模型对照组，给药后分别采用热板法和辐射热法建立小鼠热痛模型，观察不同组别给药后不同时间痛阈的动态变化；实验结束后，心脏取血，分离血清，ELISA法检测血清SP、β-EP水平。结果：BVI各剂量组和吗啡组均显示出明显的镇痛作用，BVI在热板法疼痛模型的作用具有剂量依赖性。BVI对小鼠疼痛模型血清SP、β-EP水平有一定影响，BVI各剂量组和吗啡组均对SP显示出下调效应；血清β-EP水平在BVI-L组升高，BVI-M组和BVI-H组则下降。结论：BVI对小鼠热痛模型具有显著镇痛作用，其相关机制可能与抑制内源性疼痛介质传递、增加内源性镇痛介质分泌等有关。

【关键词】 疼痛；热痛模型；注射用蜂毒；镇痛；P物质；β-内啡肽；小鼠

Effects of BVI on Pain Threshold and the Levels of SP and β-EP in Mouse Model with Heat Pain

DONG Hong，LI Zhen-bin，WANG Zhi-qiang，GAO Nan-nan，WANG Li-min，GUO Dong-liang

【ABSTRACT】Objective：To explore the analgesic effect of Bee Venom for Injection（BVI）on mouse models with heat pain and its effects on the levels of substance P（SP）and β-Endorphins（EP）in peripheral blood.Methods：Two hundred qualified Kunming mice were selected and randomly divided into the high-dose BVI（BVI-H）group，the medium-dose BVI（BVI-M）group，the low-dose BVI（BVI-L）group，the morphine group，and the model control group.After administration，hot plate method and radiation heat method were used to establish mouse models with heat pain，and the dynamic changes of pain threshold at different times in each group were observed after administration.After the experiment，blood was taken from the heart，serum was separated，and the levels of SP and β-EP in serum were detected by ELISA.Results：All dose groups of BVI and the morphine group showed significant analgesic effects，and the effect of BVI on the pain models with hot plate  was dose-dependent.BVI has a certain impact on the levels of SP and β-EP in serum，and all dose groups of BVI and morphine showed a downregulation effect on SP.The level of β-EP increased in the BVI-L group，while decreased in the BVI-M and BVI-H groups.Conclusion：BVI has a significant analgesic effect on mouse models with heat pain，and its related mechanisms may be related to inhibiting the transmission of endogenous pain mediators and increasing the secretion of endogenous pain mediators.

【Keywords】 pain;model with heat;BVI;analgesia;SP;β-Endorphins;mouse

疼痛不仅是风湿病的常见症状，更是全球性流行病［1］。目前，临床可用的镇痛药物或者疗效欠佳，或者具有多种严重不良反应，缺乏理想的效益风险比［2-3］。如阿片类和非甾体抗炎药长期应用会导致成瘾性以及胃肠道、肝肾、心血管损害等不良反应。近年来，美国推出了旨在开发新的工具和疗法对抗慢性疼痛，并减少阿片类药物依赖的大型举措［4-5］。所以，探索有效的疼痛控制是当代医学的重要研究方向之一［6-7］，而寻找高效天然的镇痛药具有重要意义。

蜂毒作为一种具有悠久历史的传统抗风湿止痛药，尽管广泛应用于肌肉骨骼疼痛、神经性疼痛等痛证，但对不同类型疼痛的作用机制迄今尚未明确［8］。中医学认为，疼痛的主要病机为“不通则痛”，诊断可参照“查色按脉，先别阴阳”进行主要分类。痛证的临床类型从性质分类则不外寒、热、虚、实［9］，从阴阳则可主要分为寒痛（阴）和熱痛（阳）两大类。关于蜂毒对寒痛模型的治疗作用及其可能机制，近年来已有多项研究报告［10-12］。为探索蜂毒对热痛的治疗作用及其机制，本研究初步观察注射用蜂毒（BVI）对2种小鼠热痛模型的镇痛效应及其对模型小鼠血清P物质（SP）、β-内啡肽（β-EP）水平的影响，以期为临床应用及蜂毒的药性研究提供实验依据，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠200只，体质量（20±2） g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0008。将实验小鼠置于光照周期为L∶D = 12∶12（明期6：00～18：00）、室温（21±3）℃的时间生物学实验室，可自由获得水和标准实验室固体饲料，饲养2周后用于实验，实验动物使用许可证号SYXK（军）2018-2002。该研究项目获得中国人民解放军白求恩国际和平医院医学伦理委员会批准（批号2020-KY-200）。

1.2 药品与试剂 BVI（华北制药厂，批号FDMG10302）；盐酸吗啡注射液（东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号200604-2）；冰乙酸（天津市致远化学试剂有限公司，批号2018-091018）；SP和β-EP ELISA试剂盒（ZCIBIO，批号20220301）。

1.3 仪 器 酶标仪（型号MK3，美国Thermo Forma）；数字式超级恒温浴槽（型号HSS-1B，中国济南益延科技发展有限公司）；鼠尾光照测痛仪（型号YLS-12A，中国济南益延科技发展有限公司）；小鼠固定筒架（型号YLS-Q1，中国济南益延科技发展有限公司）；台式高速冷冻离心机（型号TGL-16G，中国上海安亭科学仪器厂）。

2 方 法

2.1 热痛模型与动物筛选 热板法：参照文献［7］

中方法，调节恒温装置使热板温度控制在（55±0.1）℃。选择雌性小鼠，将每只小鼠单独置于热板上，小鼠出现舔后足或缩回足爪或跳离热板表面所用的时间作为终点，测量反应潜伏期作为痛阈值。在开始给药前测量2次反应潜伏期，取平均值作为该鼠的基线痛阈值。凡痛阈 < 5 s 或> 30 s者均弃之不用。

辐射热法：将小鼠置于固定筒，鼠尾暴露于外，实验前采用体积分数75%的乙醇将鼠尾擦净。鼠尾尖下1/3处用记号笔标记作为光刺激点。将鼠尾标记的光刺激点置于辐射热测痛仪光透镜焦点处，待小鼠安静后开始致痛实验。以照射开始到甩尾反应的潜伏期作为痛阈值。每只小鼠测2次，取平均值作为基线痛阈值。凡痛阈 > 9 s者弃之不用。

2.2 分组与给药 将筛选的合格小鼠，按照2种

热痛模型分别进行实验。其中热板法采用雌性小鼠，辐射热法雌雄小鼠各半。每种实验均将小鼠按照随机数字表法分为BVI低剂量（BVI-L，1 mg·kg^-1）組、BVI中剂量（BVI-M，2 mg·kg^-1）组、BVI高剂量（BVI-H，4 mg·kg^-1）组、吗啡组（10 mg·kg^-1）、模型对照组（等量生理盐水），每组20只，均腹腔注射给药。

2.3 行为学分析 热板法：各组雌性小鼠分别于腹腔注射药物或生理盐水后20，40，60，80 min，采用上述热板法测量小鼠痛阈值。60 s为截止时间，以防止小鼠足底损伤。如小鼠至60 s仍无反应，则其反应潜伏期按60 s计算。

辐射热法：各组小鼠分别腹腔注射药物或生理盐水后20，40，60，80 min，采用上述辐射热法测量小鼠痛阈值。16 s为截止时间，以防止小鼠尾部损伤。如小鼠至16 s仍无甩尾反应，则其反应潜伏期以16 s计算。

痛阈改善值=给药后痛阈-基础痛阈，采用公式计算不同药物在各个测量时间点的痛阈改善值。

2.4 血清SP、β-EP检测 上述实验结束后，将小鼠脱颈，即刻心脏采血。血液于室温静置1 h，置于离心机以3 500 r·min^-1离心10 min，离心半径10 cm，仔细收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存备检。采用ELISA法检测外周血SP、β-EP含量，按照试剂盒说明书要求在酶标仪设置相应波长测量样本光密度，根据标准曲线计算SP、β-EP的浓度。

2.5 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，组间比较采用独立样本t检验，多组计量资料采用one way ANOVA分析，LSD法进行两两组间比较；不符合正态分布组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组计量资料采用Kruskal-Wallis H检验；2组间比较采用Tambane's T2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 BVI对热板致痛小鼠的镇痛作用 吗啡组、BVI-L、BVI-M和BVI-H各用药组在给药后4个检测时间点的痛阈改善值均高于模型对照组（P < 0.01）。吗啡组的镇痛效应在给药后20 min即达到高峰，但下降较快；而BVI各剂量组随着给药时间延长，镇痛效应逐渐加强，呈现出一定量-效关系；BVI-H组在给药60 min与80 min时的痛阈改善值明显优于吗啡组（P < 0.01）。见表1。

3.2 BVI对辐射热致痛小鼠的镇痛作用 与热板法相似，在辐射热法小鼠模型中，吗啡组的镇痛作用在给药后20 min快速达到峰值，随后逐渐下降，在60 min内痛阈改善值仍高于模型对照组（P < 0.01）；但在80 min时痛阈显著下降，与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。BVI-L组和BVI-M组在给药后镇痛作用呈现逐渐增强趋势，至80 min时达到峰值，其中BVI-M组在给药后20，40，60，80 min 4个时间点痛阈改善值均明显高于模型对照组（P < 0.05或P < 0.01）。但是，在该热痛模型中，BVI-H组未显示出明显的镇痛效应，痛阈虽有改善，但与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3.3 BVI对热痛模型小鼠血清β-EP水平的影响 ELISA检测结果表明，在热板法和辐射热法2种热痛模型中，吗啡组小鼠血清β-EP水平均高于模型对照组（P < 0.01），也明显高于各BVI剂量组（P < 0.05或P < 0.01）。BVI各剂量组对上述热痛模型小鼠血清β-EP水平的影响呈现与剂量间的反比关系。BVI-L组血清β-EP水平升高，在热板法与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；但随着剂量增大，BVI-M和BVI-H组小鼠血清β-EP水平逐渐降低，甚至低于模型对照组（P < 0.01）。见表3。

3.4 BVI对热痛模型小鼠血清SP水平的影响 热板法致痛模型的BVI-M和BVI-H组，以及辐射热致痛模型的BVI-H组小鼠血清SP水平明顯低于模型对照组（P < 0.01）。吗啡组与模型对照组比较，其对上述热痛模型小鼠的血清SP水平虽有下调趋势，但差异无统计学意义（P < 0.05）。见表4。

4 讨 论

蜂毒作为一种传统的天然药物，常用于多种痛证的治疗。但由于疼痛的治疗非常复杂，临床选择有效和安全的方法进行疼痛管理仍然是一个严峻的挑战。在对痛证进行分层/分型的基础上，进一步采取针对性镇痛治疗，可能是优化镇痛方案的途径之一。从寒痛和热痛等角度分层探索蜂毒对不同类型疼痛的治疗作用及机制，将为临床应用提供重要参考。

本研究结果表明，BVI对2种小鼠热痛模型均具有明显镇痛效应。在热板法中对小鼠疼痛行为学观察发现，痛阈改善值在80 min内均呈现持续上升趋势；尽管镇痛达峰时间较吗啡慢，但持续时间较吗啡明显延长；同时，BVI还显示出对该热痛小鼠模型镇痛效应的量效关系。但是，在辐射热法小鼠模型中，BVI未显示出镇痛效应的量-效关系；并且，BVI-H组也未显示出随时间推移痛阈改善值的增加。HUH等［13］研究表明，低剂量蜂毒穴位注射（即将蜂毒注射到某个穴位，1 mg·kg^-1）比高剂量蜂毒穴位注射（2 mg·kg^-1）具有更明显的镇痛作用，即在毒液的剂量与治疗效果呈负相关，而与过敏和毒性反应呈正相关。上述结果提示，蜂毒的镇痛作用可能与其药性和用量有关。《素问·至真要大论篇》曰：“寒者热之，热者寒之。”这是中医学的基本治疗原则。在痛证方面，寒痛宜用温热药物，而热痛宜用寒凉药物。一般认为，蜂毒的中药药性为“性平，味辛”［14］。本研究证实，蜂毒对热痛模型具有显著的镇痛效应，结合有关蜂毒对寒性疼痛模型的镇痛作用研究［10-12］，似乎在镇痛方面提示蜂毒的药性“性平”，即对寒痛和热痛均具镇痛效应，其相关机制有待进一步阐明。

研究表明，某些外周血生物标志物与疼痛相关［15］。这些生物标志物检测的特异性和敏感性可能有助于疼痛的评估，并进一步提供疼痛管理的准确性。其中，SP和β-EP是重要的疼痛标志物。SP作为一种神经肽，在疼痛和炎症中发挥重要作用［16］。β-EP作为内源性阿片配体之一，是内源性镇痛的重要物质［17］。刘晓荣［18］研究发现，三叉神经痛患者血清SP水平较健康人群明显增高，且与疼痛程度呈正相关。GEHAN等［19］针对糖尿病神经病理性疼痛的临床研究表明，血清β-EP水平与患者疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分呈中度正相关。张薇薇等［20］研究表明，三叉神经痛患者经针刺治疗后，随着VAS评分的改善，血清SP水平降低，而β-EP水平增高。最近，在临床研究的基础上，血清β-EP和SP检测被应用于临床试验评估腰椎间盘突出症疼痛的改善情况［21-23］。本研究采用ELISA法检测BVI对血清SP、β-EP的影响，结果提示BVI在对热板法和辐射热法2种热痛模型小鼠发挥镇痛作用的同时，对血清SP、β-EP水平也有一定影响；BVI不同剂量组均对热痛模型小鼠血清SP水平显示出下调效应；对血清β-EP水平则仅在蜂毒低剂量组显示上调效应，且随着蜂毒剂量增加，β-EP水平反呈下降趋势。吗啡组治疗后可显著上调热痛模型小鼠血清β-EP水平，但对血清SP的作用不明显。该研究结果提示，蜂毒针对热痛模型可能具有独特的镇痛机制，需要进一步从中枢和外周等方面进行深入研究。

综上所述，本实验初步证实了不同剂量BVI对热痛模型小鼠疼痛行为学和相关血清标志物的影响，提示BVI对小鼠热痛模型具有显著的镇痛作用，其相关机制可能与抑制内源性疼痛介质传递、增加内源性镇痛介质分泌等有关。该研究为BVI对疼痛的分层治疗及其在热痛模型的镇痛作用提供了初步实验证据，今后应进一步探索其对寒痛和热痛等不同性质疼痛的镇痛最佳剂量、最佳时间以及有效成分等，以期为蜂毒的中药药性及其在临床的增效、减毒应用提供科学依据。

参考文献

［1］ JACKSON T，THOMAS S，STABILE V，et al.Prevalence of chronic pain in low-income and middle-income countries：a systematic review and Meta-analysis［J］.Lancet，2015，385（1）：S10-S16.

［2］ KAPUR BM，LALA PK，SHAW JL.Pharmacogenetics of chronic pain management［J］.Clin Biochem，2014，47（13/14）：1169-1187.

［3］ VOLKOW N，BENVENISTE H，MCLELLAN AT.Use and misuse of opioids in chronic pain［J］.Annu Rev Med，2018，29（69）：451-465.

［4］ COLLINS FS，KOROSHETZ WJ，VOLKOW ND.Helping to end addiction over the long-term：the research plan for the NIH HEAL initiative［J］.JAMA，2018，320（2）：129-130.

［5］ VOLKOW ND，MCLELLAN AT.Opioid abuse in chronic pain：misconceptions and mitigation strate-gies［J］.N Engl J Med，2016，374（13）：1253-1263.

［6］ YEKKIRALA AS，ROBERSON DP，BEAN BP，et al.Breaking barriers to novel analgesic drug develop-ment［J］.Nat Rev Drug Discov，2017，16（8）：545-564.

［7］ STEIN C，KOPF A.Pain therapy：are there new options on the horizon？［J］.Best Pract Res Clin Rheumatol，2019，33（3）：101420-101429.

［8］ SUNG SH，LEE G.Bee venom acupuncture effects on pain and its mechanisms：an updated review［J］.Toxins（Basel），2021，13（9）：608-645.

［9］ 吴承琰，李振彬.历代止痛方药精讲［M］.北京：人民卫生出版社，2021：9-10.

［10］ LI D，LEE Y，KIM W，et al.Analgesic effects of bee venom derived phospholipase A2 in a mouse model of oxaliplatin-induced neuropathic pain［J］.Toxins，2015，7（7）：2422-2434.

［11］ CHOI S，CHAE HK，HEO H，et al.Analgesic effect of melittin on oxaliplatin-induced peripheral neuropathy in rats［J］.Toxins，2019，11（7）：396-405.

［12］ YOON H，KIM MJ，YOON I，et al.Nicotinic acetylcholine receptors mediate the suppressive effect of an injection of diluted bee venom into the GV3 acupoint on oxaliplatin-induced neuropathic cold allodynia in rats［J］.Biol Pharm Bull，2015，38（5）：710-714.

［13］ HUH JE，SEO BK，LEE JW，et al.Analgesic effects of diluted bee venom acupuncture mediated by δ-opioid and α2-adrenergic receptors in osteoarthritic rats［J］.Altern Ther Health Med，2018，24（2）：28-35.

［14］ 李振彬，吳承琰.抗风湿中药学［M］.石家庄：河北科学技术出版社，2020：198-201.

［15］ SOWA GA，PERERA S，BECHARA B，et al.Associations between serum biomarkers and pain and pain-related function in older adults with low back pain：a pilot study［J］.J Am Geriatr Soc，2014，62（11）：2047-2055.

［16］ HARRIS JA，FAUST B，GONDIN AB，et al.Selective G protein signaling driven by substance P-neurokinin receptor dynamics［J］.Nat Chem Biol，2022，18（1）：109-115.

［17］ CORDER G，CASTRO DC，BRUCHAS MR，et al.Endogenous and exogenous opioids in pain［J］.Annu Rev Neurosci，2018，41（1）：453-473.

［18］ 刘晓荣.三叉神经痛患者血清SP、IL-6及PGE2变化研究［J］.中国现代药物应用，2014，8（15）：81-82.

［19］ GEHAN MA.Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation versus transcutaneous electrical nerve stimulation to decrease diabetic neuropathic pain［J］.Int JTher Rehabil，2020，27（2）：1-10.

［20］ 张薇薇，田书艺，唐甜甜，等.下关穴合谷刺联合揿针治疗痰阻血瘀型原发性三叉神经痛伴负性情绪：随机对照试验［J］.中国针灸，2022，42（9）：999-1003.

［21］ WANG XZ，XUE KY，CHEN PN，et al.Ma's bamboo-based medicinal moxibustion therapy of low back pain in lumbar disc herniation：study protocol for a randomized controlled trial［J］.Trials，2022，23（1）：446-458.

［22］ YANG S，YANG XF，JIANG Y，et al.Effect of medicinal-cake-separated moxibustion on functional activity of back-leg and plasma substance P level in patients with lumbar disc herniation［J］.Acupunc Res，2014，39（6）：491-495.

［23］ ZAI FL，WU RL，ZHENG MF，et al.Warming needle moxibustion relieves symptoms of lumbar disc herniation patients and upregulates plasma β-endorphin［J］.Acupunc Res，2018，43（8）：512-515.

收稿日期：2023-01-15；修回日期：2023-02-28