H型血管在治疗骨质疏松症中的调节作用探讨

叶香兰　黄志强　付长龙　邱志伟　谢新宇　郑钰铮

【摘 要】 H型血管作为一种高表达血小板-内皮细胞粘附分子-1（CD31）与内皮黏蛋白（Emcn）的特殊血管类型，常分布于成骨活跃的部位，因其周围聚集大量骨祖细胞，具有成血管与成骨偶联作用，与骨质疏松症病程预后转归关系密切。探讨H型血管与骨形成之间的偶联作用对骨质疏松症病理进程的影响机制，以期为骨质疏松症的防治提供新思路。

【关键词】 骨质疏松症;H型血管;成骨成血管偶联;调节机制

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨密度减少、骨组织微结构退变，骨强度降低而导致骨骼脆性升高，发生骨折的风险也随之变高为特点的全身性骨代谢性疾病[1]。随着社会老龄化进程的加快，OP成为一种以老年人群多发的疾患[2]。调查显示，2010年至2016年中国60岁以上老年人OP总体患病率为36%，其中男性为23%，女性为49%[3]。OP主要分为原发性和继发性两类，原发性OP又分为绝经后OP（Ⅰ型）、老年OP（Ⅱ型）以及特发性OP等[4]。

2014年，KUSUMBE等[5]在小鼠骨中鉴定出了两种特殊的血管亚型，分别为高表达血小板-内皮细胞黏附分子-1（CD31）和内皮黏蛋白（Emcn）的H型血管和低表达CD31和Emcn的L型血管。H型血管周围有密集骨祖细胞排列，被证实具有诱导骨形成的能力，在成骨和成血管偶联过程中至关重要，是近年来关于OP治疗的新焦点。目前对于OP的治疗往往集中于调节骨代谢方面，而涉及到骨骼血管作用的研究较少[6]。H型血管在成骨和成血管偶联中重要作用的发现，为治疗OP提供了新的突破点。

1 骨组织中H型血管的发现

KUSUMBE等[5]在发育中小鼠体内鉴定出了两种特殊的毛细血管亚型，根据两者特定的形态、分子和功能特性分为H型血管和L型血管。H型血管直接与成骨成血管偶联，在免疫组织化学染色中呈现CD31（别称PECAM1）和Emcn强阳性，且靠近生长板的干骺端和股内膜处，呈直柱状，由远端血管环或拱形连接，周围存在排列密集的骨祖细胞，能产生独特的代谢和分子微环境，介导骨骼血管的生长，维持血管周围骨祖细胞，并且结合血管生成和骨形成。骨代谢是新骨形成和旧骨吸收维持动态平衡的过程，这一平衡状态决定着骨重建[7]。

随着年龄的增长和雌激素、降钙素等激素水平下降，骨平衡会朝破骨方向转移发生骨代谢失衡，致使OP出现，因此维持骨平衡、促进骨重建对预防和治疗OP具有重要意义[8]。血管网络为周围骨组织提供必要的营养物质、氧气，也是代谢废物的通道，近来研究表明其在促进新骨生成和增强成骨成血管偶联中也发挥重要作用[9-10]。骨生成和骨血管生成之间在时间与空间上的密切关系被称为“成骨成血管偶联”，是骨稳态调节的关键因素之一。此外，LANGEN等[11]采用遗传谱系追踪技术发现，胚胎和出生后早期长骨含有一种特殊的血管亚型，称为E型血管，它强烈支持成骨细胞系细胞，后来向H型血管转变，E型和H型血管均可分化为L型血管和小动脉，提示E型和H型内皮细胞是骨中大多数内皮细胞的上游细胞。

2 H型血管在骨形成中的作用

相关研究证实，人体骨骼内存在H型血管，其数量随年龄的增加而逐渐减少，骨密度与其数量呈正相关[12]。非OP性骨折患者H型血管较多且分布完整，呈柱状、弓状;OP性骨折患者H型血管稀疏、分布凌乱，呈窦状，其骨体积分数、骨小梁厚度和数目明显减少，骨祖细胞数量显著降低[13]。WANG等[14]研究发现，在正常大鼠骨损伤的修复过程中H型血管在修复区呈现大量增生并广泛分布，而OP大鼠骨损伤修复过程中H血管分布减少，同时损伤后7 d、14 d，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子A、骨形态发生蛋白-2和Osterix的转录水平下降，伴随骨小梁的数量和厚度明显减少、结构紊乱、间隙增加;并且，H型血管在生长前沿的新生骨小梁表面远多于远离生长前沿的骨小梁表面，表明H型血管在骨缺损修复过程中支持边缘生长区新骨的形成。另有研究发现，H型血管和周围成骨祖细胞的数量随小鼠年龄增加而显著降低，但通过药物治疗可使这种情况逆转，使骨骼质量得以恢复[15]，提示通过H型血管形成诱导骨形成，有望成为一种治疗OP的新手段。H型血管与骨形成之间偶联关系的发现，为OP的治疗提供了新的突破口。

3 影响H型血管形成与骨形成的相关因素

H型血管与成骨的紧密耦合，提示H型血管的生成与成骨存在某种分子信号通路，保证了骨生成与血管生成之间的“偶联关系”。成骨成血管偶联涉及破骨、成骨、成血管等多种生理过程，关于H型血管与成骨的偶联关系的机制的探讨，目前已经确定了以下几种因素可调节H型血管形成和骨形成。

3.1 破骨前体细胞和血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB） H型血管和成骨的“偶联机制”可为破骨前体细胞分泌的PDGF-BB进行强化。此观点被认为是对以往“骨量变化与成骨细胞-破骨细胞平衡、钙丢失、维生素D减少相关”的重大补充[16]。XIE等[17]证实，由破骨前体细胞分泌的PDGF-BB可以在骨骼的塑造与重塑过程中促进H型血管的形成和骨形成。破骨前体细胞分泌的PDGF-BB与血小板衍生生长因子受体β结合，诱导间充质干细胞（MSC）和骨髓来源的内皮母细胞迁移，并分别分化为成骨细胞和H亚型内皮细胞[17]。YANG等[18]证实，PDGF-BB通过增强内皮祖细胞的血管内皮生长因子（VEGF）信号保护内皮血管的形成，并通过对H型血管和成骨细胞的保护作用减弱糖皮质激素诱导的成年小鼠OP。目前研究大都通过直接或间接调节破骨细胞以调控PDGF-BB的生成，如通过GIT1[19]、卵磷脂[20]、蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2（NSC-87877）[21]以及骆驼蓬碱（一种β-Caroline生物碱）[22]促进成骨与成血管偶联，用以治療OP。

有研究发现，巨噬细胞系骨膜抗酒石酸酸性磷酸酶阳性（TRAP+）细胞，通过分泌PDGF-BB诱导骨膜衍生细胞（PDCs）表达和募集到骨膜成骨微环境中，募集的PDCs参与了成骨细胞分化，促进了骨形成和H型血管再生[23]。TRAP+破骨前细胞的破骨细胞成熟化减少了PDGF-BB的分泌，SONG等[20]研究发现，通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和核转录因子-κB信号通路，天然的生物活性化合物-核苷（Nuciferine）可以通过保存TRAP+破骨细胞从而减少多核破骨细胞的形成，增加股骨中PDGF-BB的浓度和H型血管的数量，对去卵巢小鼠具有骨保护作用，可作为治疗骨丢失疾病的一种药物。

3.2 轴突导向分子SLIT3 轴突导向分子SLIT3是一种SHN3调节的促血管生成因子[24]。KIM等[25]发现，破骨细胞衍生的SLIT3是一种强效局部决定因子，在调节成骨细胞和破骨细胞性能中起着关键的作用。一方面，SLIT3通过激活β-连环蛋白，刺激成骨细胞迁移至骨重建部位并增殖;另一方面，SLIT3自分泌抑制破骨细胞的分化从而抑制骨吸收。研究发现，SLIT3或其受体Robo1缺乏的小鼠H型血管数量显著减少，并由于破骨水平高于成骨水平表现出骨量的减少。KIM等[25]制作了一种截短型重组SLIT3-LRRD2，SLIT3-LRRD2能有效缓解去卵巢小鼠骨质丢失，但并未明显增加小鼠骨量且需要多次注射。这些结果证实了SLIT3在H型血管生成过程中的重要性，并显示其可同时调控骨形成与骨丢失，这为开发出双活性药物提供了分子基础[26]。

3.3 MSC亚群：Gli1+细胞 MSC是多能干细胞，为骨髓基质细胞的主要细胞类型，可诱导分化为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等多种类型细胞，参与血管内皮生成和修复，具有一定的成骨潜能[27-28]。Gli1+细胞是MSC的一个亚群，广泛分布于各种器官中，具有重要生物学功能。在骨组织中，Gli1+细胞可作为成骨细胞的祖细胞参与长骨发育和修复[29-30]。CHEN等[31]研究结果显示，Gli1+细胞与H型血管形成耦合并调节H型血管生成。H型血管为骨中Gli1+细胞毗邻分布的优选血管亚型，且Gli1+细胞和H型血管内皮细胞在总骨细胞中的频率随年龄协同变低，并伴随骨祖细胞标志物RUNX2下降。在骨缺损或骨折愈合早期，愈合区Gli1+細胞明显上调并引导H型血管形成。注射他莫昔芬消融小鼠骨骼中的Gli1+细胞，观察到干骺端和骨干端H型血管的急剧减少并伴随着RUNX2+骨祖细胞的显著丧失，骨体积/组织体积和骨小梁数量减少。Gli1+细胞消融导致HIF-1α信号显著抑制，提示Gli1+细胞可能由HIF-1α信号调控H型血管形成[31]。

3.4 HIF-1α HIF-1α是HIF-1的活性亚基，受缺氧信号的调控，其基因定位于人的14号染色体（14q21～24），可调控促血管生长因子、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子的表达，诱导内皮细胞增殖，促进血管生成[32-34]。相关研究发现，HIF-1α表达水平降低的小鼠其骨骼中H型血管和骨祖细胞数量明显减少，L型血管数量不受影响。相反，提高小鼠骨骼中HIF-1α的表达水平会导致H亚型内皮细胞增加和干骺端血管柱的显著扩张，伴随干骺端的扩张和骨祖细胞的增多，由此可见，H型内皮细胞和骨祖细胞的增殖与HIF-1α的水平呈正相关;该研究亦发现，H亚型内皮细胞在幼年小鼠体内高表达，表达水平随着小鼠年龄的增长而逐渐减低。总之，HIF-1α在调节H型血管生成与骨形成的过程中起着至关重要的作用[35]。PENG等[36]研究结果表明，缺氧模拟剂二甲基草酰甘氨酸激活了HIF-1α信号通路，进一步激活了Wnt/β-catenin信号通路，并增强了MSC成骨分化，促进血管生成和成骨作用。YANG等[37]发现，MIR-497～195簇通过维持内皮HIF-1α和Notch活性调节成骨成血管偶联过程中H型血管生成。

3.5 糖原合成激酶3β（GSK-3β） GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物真核细胞中，可调节细胞的分化、增殖、存活和凋亡，在肿瘤、神经退行性疾病等疾病研究中越来越受到重视[38-39]。GSK-3β直接调控成血管的研究主要集中在其调控VEGF方面，GSK-3β具有降解HIF-1α的作用，而HIF-1α可以直接促进VEGF的表达[40]。GSK-3β通过其激酶活性作用，参与Wnt信号通路，对成骨、成血管作用进行调节[41]。胡祥翔[42]研究证实了GSK-3β在成骨和成血管偶联中的作用，研究发现，去卵巢OP模型小鼠股骨骨密度明显下降，同时伴有GSK-3β和H型血管明显下降，而GSK-3β+/-小鼠对去卵巢后骨质疏松有明显的拮抗作用;并且，通过对分别来源于GSK-3β+/-小鼠（高GSK-3β活性）、野生型小鼠（正常GSK-3β活性）以及LiCl环境下野生型小鼠（低GSK-3β活性）的骨髓单体巨噬细胞进行破骨诱导，发现高GSK-3β活性下可加快单核巨噬细胞分化为破骨前体细胞，低GSK-3β则会抑制这一过程;且GSK-3β+/-小鼠组条件培养液中的PDGF-BB含量高于野生型小鼠组，LiCl组条件培养液PDGF-BB含量低于野生型组。提示GSK-3β可以通过调节单核巨噬细胞分化为破骨前体细胞的速度从而调节PDGF-BB的分泌，进而影响H型血管生成和成骨成血管偶联，以维持骨稳态。

3.6 Notch信号与Noggin蛋白 RAMASAMY等[43]证实了Notch信号在成骨和成血管偶联中的重要作用。Notch信号作用于H亚型血管内皮细胞，使其增殖并分泌形态蛋白拮抗剂（Noggin）。Noggin蛋白可促进骨祖细胞增殖、分化和软骨细胞的成熟、肥大，恢复Sox9蛋白局部表达水平，而骨祖细胞和软骨细胞可高分泌VEGF引导血管出芽，促进内皮细胞成熟和血管形成[44]。内皮细胞Notch信号通过Noggin和VEGF有序地调控骨祖细胞、软骨细胞及内皮细胞间的信号传递。研究通过对小鼠使用Notch受体失活剂，使Notch增加，发现H型血管和Runx+骨祖细胞的数量以及Noggin蛋白的分泌增加。相反，在Notch信号传导遗传破坏的小鼠中，出现H型血管和Runx+骨祖细胞的数量以及Noggin蛋白的分泌减少的现象。由此证实，Notch信号是连接H型血管内皮细胞和成骨作用之间的关键成分[45]。

4 结语和展望

OP的发病率和致残率逐年增高，严重影响患者的日常生活和心理健康。因此，对OP的病因、发病机制及预防治疗等问题的进一步探讨，有着重要而深远的现实意义。H型血管形成与成骨偶联关系的发现，使我们对成骨与成血管之间的相关分子作用机制有了新的认识。目前关于H型血管的研究大多都仅限于动物实验，验证H型血管在人OP中的作用需进一步研究。相关药物在靶向H型血管治疗OP上确有一定疗效，但缺乏严格和标准化的大样本临床试验，在循证医学方面缺乏足够的证据，应开展多中心、大样本、双盲、随机、对照试验，以期进行更加科学的评估。其次，鉴于当前对于OP的治疗集中于调节骨代谢等方面，可以考虑靶向H型血管用药与传统药物或治疗技术相结合的办法，以期发挥更佳疗效。此外，H型血管的形态、数量以及特异性分布特点可考虑作为诊断OP和评估药物疗效的指标之一。将来，针对H型血管的治疗方法有望成为OP临床治疗的新途径之一。

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收稿日期：2020-04-20;修回日期：2020-05-19