膝关节炎治疗仪对SNP诱导体外大鼠软骨细胞凋亡的影响

林洁++付长龙++叶锦霞++陈俊++吴广文

【摘 要】目的：观察膝关节炎治疗仪对硝普钠（SNP）誘导体外大鼠软骨细胞凋亡的影响。方法：采用膝关节炎治疗仪不同刺激强度干预1 mM SNP诱导第2代大鼠软骨细胞的凋亡模型，镜下观察软骨细胞形态，用噻唑蓝（MTT）法检测软骨细胞的活力，倒置荧光显微镜观察细胞核形态及密度变化。结果：倒置相差显微镜下观察膝关节炎治疗仪能减少细胞凋亡，MTT发现4级干预强度抑制细胞凋亡效果最佳，4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色观察其能有效减轻软骨细胞核固缩。结论：膝关节炎治疗仪可能通过抑制软骨细胞凋亡从而达到防治骨关节炎的作用，但其具体抗凋亡途径有待进一步揭示。

【关键词】 骨关节炎；膝关节炎治疗仪；软骨细胞；凋亡；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of therapeutic instrument for knee osteoarthritis on apoptosis of chondrocytes induced by sodium nitroprusside（SNP）in vitro.Methods：The rat（GenerationⅡ）model with apoptosis of chondrocytes induced by 1 mM SNP in vitro was intervened with different stimulus intensities，observing the morphous of chondrocytes under microscope，detecting the vitality of chondrocyte with MTT，and observing the morphous of nucleus and the changes of density under inverted fluorescent microscopy.Results：Observed under the microscope，the therapeutic instrument for knee arthritis could reduce cell apoptosis.MTT showed that 4-scale intervention was the best intensity to inhibit apoptosis.According to DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）staining，it could effectively reduce nuclear pyknosis.Conclusion：The therapeutic instrument for knee osteoarthritis can prevent and treat osteoarthritis by inhibiting apoptosis of chondrocytes，but the specific anti apoptotic pathway needs to be further revealed.

【Keywords】 osteoarthritis；therapeutic instrument for knee osteoarthritis；chondrocytes；apoptosis；rats

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨变性、破坏及骨质增生为主要病理特征的常见慢性关节性疾病[1]。随着社会老龄化趋势的来临，OA患者越来越多，尽管花费大量资源研究本病但仍未发现特效治疗方法[2]，故寻求一种有效缓解症状、操作方便、大众化的治疗方法成为未来需求。膝关节炎治疗仪（knee arthritis therapeutic apparatus，KATA）是专门针对OA患者研制的一款便捷式家用治疗仪[3]，课题组前期研究表明，KATA具有疏通经络、行气活血、滑利关节的作用，能有效减轻病理表现、调节细胞因子分泌、促进软骨细胞增殖[4-8]。现观察KATA对体外培养大鼠软骨细胞凋亡的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄清洁级SD雄性大鼠6只，体质量60～80 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。动物处置按照科技部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》执行。

1.2 主要试剂 磷酸盐缓冲液（HyClone，生产批号AB217272）；Ⅱ型胶原酶（VETEC，生产批号V900892-100MG）；DMEM（改良培养基）/LOW GLUCOSE（HyClone，生产批号ABB210359）；胎牛血清（HyClone，生产批号AAD201365）；青/链霉素（HyClone，生产批号J160002）；0.25%胰蛋白酶（HyClone，生产批号J150037）；MTT粉末

（Life Science，生产批号1415C035）；4%多聚甲醛溶液（Solarbio，生产批号20140828）；DAPI染料（Life Technologies，生产批号1753067）。

1.3 主要仪器 KATA（福建省祥兴电子科技有限公司）；AE100电子秤（瑞士Metter公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；倒置显微镜系统（德国Leica仪器有限公司）；多功能酶标仪（奥地利TECAN公司）；Olympus IX70倒置荧光显微镜（日本Olympus株式会社）。

2 实验方法

2.1 软骨细胞的分离和培养 6只SD大鼠，采用20 g·L-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，消毒并离断双膝，在750 mL·L-1乙醇中浸泡5 min，放入含双抗磷酸盐缓冲液（PBS）中。于超净台处剥离关节周围肌肉、韧带，剔除软骨表面的滑膜，切割软骨，将其切碎成1 mm×1 mm×1 mm大小；后用PBS冲洗3次，将其置入含有3 mL质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶培养皿，将培养皿放在含体积分数为5%的CO2 37 ℃培养箱中；每90分钟吸取上清于15 mL离心管中，1000 r·min-1离心机离心5 min，收集细胞沉淀；更换消化液继续消化，重复3次。用DMEM完全培养液（含质量分数为10%的胎牛血清，青链霉素100 U·mL-1），重悬细胞，接种于25 cm3培养瓶中培养；48 h后首次换液，以后每48 小时换液1次。待软骨细胞铺满至80%～90%瓶底，用胰酶消化传代。实验使用第2代软骨细胞。

2.2 倒置显微镜观察软骨细胞形态 取生长良好的第2代软骨细胞调整为细胞密度1×105·mL-1后，接种于6孔板中，每孔2 mL，放置于细胞培养箱中。48 h后，将细胞随机分为空白对照组、模型对照组[1 mM硝普钠（SNP）诱导24 h]、干预组1（1 mM SNP + KATA 2级强度干预30 min，每日3次）、干预组2（1 mM SNP + KATA 4级强度干预30 min，每日3次）、干预组3（1 mM SNP + KATA 6级强度干预30 min，每日3次）、干预组4（1 mM SNP + KATA 8级强度干预30 min，每日3次）。其中造模方法参照文献[9]，用SNP诱导软骨细胞24 h，具体干预操作同前期实验干预方法[10]：将预置铂丝的六孔板盖子换到含有细胞的六孔板上，再连接KATA进行干预。实验结束后，于倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态。

2.3 MTT检测软骨细胞活性 按照2.2项中的分组及处理方法干预软骨细胞，24 h后，弃去培养液，用PBS洗涤1次，在6孔板中每孔加入l mL质量分数为0.5% MTT溶液，37 ℃孵育4 h后，吸弃MTT溶液，加入1 mL DMSO，振荡10 min，转移至96孔板，在多功能酶标仪处检测每孔OD值，测量波长570 nm。重复实验5次，每次设6个

复孔。

2.4 DAPI染色观察软骨细胞调亡情况 取生长良好的第2代软骨细胞调整为细胞密度1×105·mL-1后，接种于6孔板中，每孔2 mL，放置于细胞培养箱中。48 h后，将细胞随机分为空白对照组、模型对照组（1 mM SNP诱导24 h）、干预组（1 mM SNP + 采用2.3中MTT实验发现的最佳作用强度进行干预30 min，每日3次）。干预24 h后，弃培养液，每孔加入500 μL质量分数为4%的中性甲醛，于4 ℃冰箱固定。30 min后吸弃固定液，PBS洗3次，按每孔500 μL加入DAPI染液，室温避光孵育5 min后弃染液，PBS洗3次，荧光倒置显微镜观察软骨细胞核的形态，并计算细胞的凋亡率。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，各组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差異有统计学意义。

3 结 果

3.1 KATA对各组大鼠软骨细胞形态的影响 空白对照组细胞形态表现为分布均匀、细胞密度较大，见图1（1）；模型对照组和干预组4则见软骨细胞数量减少，大部分细胞发亮、变小，培养液中可见飘浮软骨细胞，见图1（2）、1（6）；干预组1，2，3中细胞发亮、数量减少程度较模型对照组低，培养液中见有少量漂浮软骨细胞，见图1（3）、

1（4）、1（5）。

3.2 KATA干预强度与各组大鼠细胞活性的关系 模型对照组的软骨细胞活性明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；干预组1，2中软骨细胞活性高于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），其中干预组2的细胞活性较好；干预组3，4软骨细胞活性有较模型对照组好的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3.3 KATA干预后各组大鼠软骨细胞的凋亡情况 空白对照组软骨细胞密度较大且均匀分布，细胞核表现为均匀亮蓝色荧光；模型对照组细胞密度较

小，细胞核呈发亮、固缩、碎裂状态，细胞凋亡率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；干预组可见部分细胞核固缩、发亮，但其细胞密度较模型对照组大，凋亡情况较模型对照组轻，细胞凋亡率与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2、表2。

4 讨 论

关节软骨具有承受力学负荷、吸收和缓冲应力、润滑等作用[11]，OA最主要的病理表现为软骨损害和退变。关节软骨是由软骨细胞、基质及胶原纤维构成，软骨细胞作为其唯一存在的细胞，增殖、凋亡和分化对于软骨损伤及重塑具有重要影响。细胞凋亡指细胞在一定条件下，遵循自身的程序，主动结束生命的过程，是维持机体环境稳定的重要因素。越来越多的证据表明，软骨细胞的凋亡与OA的发生发展具有密切关系[12-14]，调节软骨细胞凋亡对于OA防治具有重要意义，故一种有效抑制软骨细胞凋亡的疗法，可较好地控制、延缓OA的病情进展。

KATA是一种物理治疗仪，输出波形为疏密波，密波2.2 s，疏波1.1 s，周期为3.3 s，密波频率100 Hz，疏波频率2 Hz，设有不同等级刺激强度以供使用者自行选择。前期临床试验表明KATA对OA具有一定的治疗作用[8，15]，前期动物实验表明KATA能明显改善大鼠关节软骨损害、延缓软骨细胞的退变[6]，但其对软骨细胞凋亡的影响尚不明确，故本实验从KATA对SNP诱导体外软骨细胞凋亡的影响出发，以期为解答此疑问提供一些线索。

本实验通过倒置相差显微镜下观察，发现KATA能减少软骨细胞凋亡。通过MTT检测，结果显示，干预组1，2，3，4中细胞活性均有优于模型对照组的趋势，干预组1，2与模型对照组细胞活性比较，差异有统计学意义（P < 0.05），其中又以干预组2细胞活性较高，即4级干预强度能最佳地抑制细胞凋亡。DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于观察细胞凋亡变化情况。本实验中，荧光显微镜下观察发现，干预组细胞核发亮、核固缩情况较模型对照组轻，差异有统计学意义（P < 0.05）。

本实验发现，KATA能减少软骨细胞凋亡，为KATA防治OA提供了实验依据，但其在体外实验中发挥抗凋亡作用的具体途径有待后期研究进一步补充。本研究存在一些不足之处，如两电极间距、培养液不同造成电阻不同，从而导致电流刺激不尽相同，这些物理学、生物学方面的问题还有待多学科合作共同解决。

5 参考文献

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收稿日期：2016-10-28；修回日期：2017-03-13