miR-29a影响eNOS蛋白表达参与血管内皮障碍机制研究

邹鹏涛，何磊，张方，朱波

南昌大学第二附属医院心血管内科，江西南昌 330006

冠心病是心血管疾病中的常见病症，其病变机制为冠状动脉出现粥样病变，最终使个体出现诸如心肌缺血、缺氧或坏死等临床症状[1-2]。全球每年死于冠心病的病例总数近700万，位居单病种死因之首[3]。miRNA已被多项研究证实参与动植物基因表达调控，主要机制为通过降解靶基因mRNA或调控其蛋白表达影响机体生理机制[4]。miR-29a是miRNA的一员，被证实广泛参与多种心血管疾病的发生和发展。张建兴等[5]研究发现心肌梗死患者血清miR-29a水平显著高于不稳定型心绞痛患者，提示miR-29a与心肌缺血-再灌注关联密切。Yang等[6]研究发现结直肠癌患者中miR-29a表达显著上调，而通过抑制miR-29a的表达可发挥抑制癌细胞迁移和侵袭的作用。Silvis等[7]研究发现炎症反应促进多种炎症因子分泌，炎症因子进一步加重冠状动脉内皮细胞损伤，加快动脉粥样硬化进程。关于miR-29a对冠心病患者内皮细胞损伤的研究较多，但对其机制的探索较少，本研究旨在通过体外细胞实验分析炎症因子对miR-29a及其对应蛋白表达的影响，以期为冠心病患者的治疗提供新的理论参考。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与材料

原代人脐静脉内皮细胞及内皮细胞培养基（美国Sciencell公司）、荧光检测试剂盒、细胞培养箱（美国赛默飞世尔科技公司）、蛋白核酸定量仪（美国贝克曼库尔特有限公司）、凝胶成像系统（青岛奥特凯美软控技术有限公司）、蛋白垂直电泳仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.2 细胞培养与增殖过程

冻存细胞用37℃水浴融化后，在4℃环境下以3000转/min离心。在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的改良RPMI-1640培养基中重悬生长。增殖过程选取对数生长期的细胞稀释至1×103cell/ml。将琼脂与培养基按1∶9的比例充分混合，加入平板中，放置在室温下使琼脂固化，然后接种细胞悬浮液混合物（1.5ml）和等体积的0.5%软琼脂。将板置于37℃、5% CO2的培养箱中，培养两周后，使之生长至合适细胞密度。将肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）及血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）分别加入内皮细胞培养基中进行培养，培养时间为4～48h。

1.3 反转录和定量聚合酶链反应分析

向收集的培养细胞中加入TRIzovl试剂以提取总RNA。反转录试剂盒按照ABI公司（美国）反转录试剂盒说明进行操作。cDNA为模版反应体系和条件：体系包含10μl去离子水、1μl寡核苷酸（oligonucleotide，dT）、2µl RNA，16℃条件下孵育30min，在体系内2μl脱氧核糖核苷酸三磷酸、1μl RNA抑制酶、4μl上样缓冲液42℃孵育30min，85℃加热5min，迅速冷却后，置于4℃环境中保存。将得到的样本进行实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR），采用TaqMan Universal PCR Master Mix 20μl反应体系，在罗氏（瑞士）LightCycler480仪器上操作，以β-action作为表达检测的内参。预变性10min；于95℃条件下变性15s，后60℃条件下退火30s，70℃条件下延伸30s，进行40个循环的扩增，β-action上下游引物序列：5'-TCAG GTCATCACTATCGGCAAT-3'，5'-AAAGAAAGGGT GTAAAACGCA-3'。miR-29a上下游引物序列：5'-CC CATCTATGAGGGTTACGC-3'，5'-TTTAATGTCACG CACGATTTC-3'。

1.4 实时定量PCR检测及蛋白质印迹分析

使用EzOmics one-step qPCR试剂盒对细胞系内皮细胞中的miR-29a及内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达情况进行检测，检测仪器为stratagene Mx3000 pTM型实时定量PCR仪，miR-29a值以U6值作为参照，eNOS值以GAPDH作为参照，分别计算miR-29a及eNOS的表达情况。在37°C条件下以4000转/min离心5min收集细胞，将细胞（1×106）在250µl放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denatured polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离50µg细胞蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯膜，加入1∶3000稀释后转化因子2β（transforming factor 2β，TRA2β）的大鼠抗人单克隆抗体后在4°C下孵育过夜。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline solution，PBS）洗涤3次后将辣根过氧化物酶偶联的山羊抗大鼠二抗以1∶3000的稀释度在室温下静置处理30min，洗去所有未偶联的抗体。使用Western荧光检测试剂染色，用BandScan 5.0软件观测成像光密度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 炎症因子TNF-α和SAA对细胞miR-29a表达的影响分析

加入TNF-α和SAA并未使miR-21、miR-29b、miR-29c的表达水平出现明显变化（P>0.05）；但miR-29a的表达水平较对照组显著提高（P<0.05）；加入TNF-α与加入SAA的细胞系中miR-29a表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1、图1。

图1 TNF-α和SAA对细胞miR-29a表达的影响

表1 TNF-α和SAA对细胞miR-29a表达的影响分析（±s）

表1 TNF-α和SAA对细胞miR-29a表达的影响分析（±s）

指标 TNF-α（ng/ml）SAA（U/L） 对照组 t P miR-21 1.05±0.21 1.07±0.15 1.03±0.18 0.635 0.551 miR-29a 2.21±0.26 2.38±0.18 1.04±0.15 0.816 0.236 miR-29b 1.10±0.10 1.09±0.15 1.06±0.11 2.659 0.021 miR-29c 1.12±0.11 1.13±0.15 1.10±0.17 0.165 0.897

2.2 炎症因子水平及作用时间对miR-29a表达影响的分析

qRT-PCR检测显示，随着加入炎症因子水平的升高，细胞系中miR-29a表达也呈现明显的升高趋势，见表2、图2。以1.0ng/ml的TNF-α及SAA作为恒定水平进行干预，观察炎症因子作用时间对miR-29a表达的影响，结果显示随着时间推移，miR-29a表达也呈现明显的升高趋势，见表3、图3。

图2 炎症因子水平对miR-29a表达的影响

图3 时间对miR-29a表达水平的影响

表2 炎症因子水平对miR-29a表达影响的分析（±s）

表2 炎症因子水平对miR-29a表达影响的分析（±s）

炎症因子水平（ng/ml）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 1.04±0.15 1.01±0.18 0.516 0.419 1 2.21±0.26 2.38±0.18 0.635 0.411 10 2.59±0.15 2.61±0.16 0.951 0.215 20 2.73±0.11 2.81±0.16 0.669 0.411

表3 时间对miR-29a表达影响的分析（±s）

表3 时间对miR-29a表达影响的分析（±s）

炎症因子加入时间（h）TNF-α（ng/ml） SAA（U/L） t P 0 2.21±0.26 2.20±0.18 0.441 0.635 4 2.34±0.14 2.41±0.15 0.951 0.236 12 2.46±0.12 2.51±0.11 0.746 0.431 24 2.68±0.18 2.67±0.17 0.635 0.441

2.3 炎症因子对eNOS蛋白表达水平影响的分析

采用Western blot对TNF-α及SAA通过细胞系作用于eNOS蛋白表达水平影响进行分析，结果显示，相较于对照组，加入TNF-α及SAA均可导致eNOS蛋白表达的下调，见图4。

图4 炎症因子对eNOS蛋白表达水平的影响

2.4 丹参对miR-29a及eNOS蛋白表达影响的分析

丹参不同剂量、不同作用时间对miR-29a表达水平影响的分析结果显示，miR-29a表达水平随着丹参浓度的升高呈降低趋势；恒定浓度下，随着时间的推移，miR-29a表达水平呈降低趋势，见图5。加入丹参可使eNOS蛋白表达升高，见图6。

图5 丹参对miR-29a表达水平的影响

图6 丹参对eNOS蛋白表达的影响

3 讨论

冠心病的发病机制及病因在不同患者中存在较大的差异，患者面临的临床风险也存在较大差异[8]。当前临床上主要将心电图、心肌损伤标志物用于冠心病的诊断中，但上述检测方式均存在一定的局限性，冠心病患者的早期诊断难度较大[9]。针对冠心病流行病学的研究指出，近些年冠心病患者的预后呈好转趋势，但仍有部分患者在干预后数月或数年后出现急性心肌梗死[10]。目前针对上述现象的研究属于热点方向之一，通过筛选心血管时间或死亡高风险患者并进行标志物的分析，对降低冠心病患者病死率具有积极意义。

miRNA主要作用机制为通过降解或翻译抑制实现对靶基因的负调控，进而起到调控生理机制的作用[11]。人类基因组中约有1881条miRNA前体，影响约60%人类基因组中基因片段的表达，提示miRNA对人体多项生物进程如细胞分化、增殖、凋亡等发挥重要作用[12]。有研究指出，miRNA参与内皮细胞功能调控、平滑肌细胞增生、新生血管形成等进程，同时还影响恶性肿瘤细胞的迁移、凋亡等[13-14]。miR-29a是miRNA家族中的一员，已有研究指出，miR-29a在多种癌组织中呈现过表达状态，与癌症的发生、发展有密切联系[15]；但关于miR-29a对冠状动脉内皮细胞凋亡及炎症因子表达的相关研究较少。本研究通过体外细胞实验，发现加入TNF-α与SAA并未使miR-21、miR-29b和miR-29c的表达水平出现明显变化，但miR-29a的表达水平较对照组显著提高，提示TNF-α及SAA可通过影响miR-29a的表达参与机体血管内皮细胞的病变进程。本研究进一步分析剂量及作用时间对miR-29a表达水平的影响，提示随着炎症因子水平的增加及作用时间的延长，miR-29a表达量均呈现升高趋势，进一步证实炎症因子TNF-α及SAA诱导miR-29a的表达，且这种诱导呈现剂量及时间依赖。

本研究分析炎症因子对eNOS蛋白表达水平的影响，显示加用TNF-α及SAA均导致eNOS蛋白表达的下调，与对照组比较差异有统计学意义。魏艳胜等[16]发现eNOS蛋白广泛参与冠状动脉内皮细胞损伤进程，而加入谷红注射液可明显提高eNOS表达水平，从而提高冠状动脉内皮细胞的存活率。本研究中炎症因子的引入使eNOS蛋白表达降低，却提高miR-29a的表达量，提示miR-29a可通过影响eNOS蛋白的表达参与内皮细胞损伤进程。吴莹[17]的研究证实eNOS是miR-29a的靶标。另有研究认为miR-29a通过影响eNOS蛋白的表达，在肾间质纤维化、心肌纤维化等病变中发挥重要作用，与本研究结论相似[18]。最后为反向论证本研究的结论，研究中引入血管保护性药物丹参，加入丹参后可抑制miR-29a的表达，增加eNOS蛋白的表达，提示miR-29a正是通过影响eNOS蛋白的表达参与血管内皮功能变化进程，而使用血管保护性药物则可特异性降低miR-29a的表达，增加eNOS蛋白的表达。

综上所述，炎症因子TNF-α和SAA可通过诱导miR-29a表达参与血管内皮损伤进程，eNOS蛋白广泛参与该进程，而应用血管保护性药物可一定程度上抑制miR-29a的过表达，降低eNOS蛋白的表达量，从而发挥保护血管的作用。