腺苷A2a受体在系统性硬化症相关间质性肺病中的作用及机制研究

戴才俊，董一枝，严丹，涂军伟

浙江大学医学院附属金华医院 金华市中心医院呼吸与危重症医学科，浙江金华 321000

系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）又称硬皮病，是一种病因尚未完全明确、诊治困难的自身免疫性疾病。该病具有弥漫皮肤或局部器官纤维化、血管病变及免疫学异常三大特征[1-2]；局部内脏器官病变以系统性硬化症相关间质性肺病（systemic sclerosis associated interstitial lung disease，SSc-ILD）最常见，通常表现为肺部间质性炎症或纤维化，至今尚缺乏对SSc-ILD的有效治疗措施，使其成为硬皮病患者的主要死亡原因之一[3-4]。目前治疗SSc-ILD的主要药物有激素和环磷酰胺等，但效果均欠佳，且有继发感染、骨髓抑制等严重并发症[5]。因此探明SSc-ILD的发病机制，寻求疗效好且副作用小的药物治疗SSc-ILD是一项重要的研究课题。

近年来研究发现腺苷A2a受体（A2a receptor，A2aR）参与炎症、缺氧、氧化应激损伤等过程[6-8]。在肺缺血再灌注模型中，A2aR激活减少白细胞黏附的同时可抑制活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，从而抑制氧化应激反应，减轻肺组织渗出[9]。另有研究发现氧化应激参与SSc-ILD的发生、发展[10-11]。目前A2aR对SSc-ILD的作用及机制研究较少，本研究拟建立次氯酸诱导的小鼠SSc-ILD模型，探讨A2aR激活是否通过降低氧化应激水平减轻SSc-ILD的炎症及纤维化程度。

1 材料与方法

1.1 实验动物及标本

选取24只健康雌性Balb/c小鼠[购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2022-0004]，均为6周龄，体质量18～22g。饲养条件：无特定病原体环境，室温20～24℃，给予充足水和饲料。将小鼠随机分为三组（n=8）：正常对照组（wild normal control group，WN组）、造模组（wild model group，WM组）、造模+A2aR激动剂（CGS21680）组（WM with CGS21680 group，WMC组）。WN组小鼠背部注射300μl无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），WM组和WMC组小鼠背部注射300μl次氯酸溶液，1次/d，连续造模6周。造模后予腹腔注射给药，WN组和WM组小鼠腹腔注射0.5ml无菌PBS溶液，WMC组小鼠腹腔注射0.5ml无菌CGS21680溶液,连续注射6周。各组小鼠结束注射2周后，颈椎脱臼法处死小鼠，心脏取血并分离血清，检测血清晚期氧化蛋白产物（advanced protein oxidation products，AOPP）。取小鼠肺组织分成两部分：一部分立即用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和马松染色；另一部分立即置于液氮中，低温（-80℃）保存备用，测定羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）、AOPP、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量。本研究经金华市食品药品检验检测研究院实验动物伦理委员会审批通过（伦理审批号：AL-JSYJ202209）。

1.2 主要试剂与仪器

磷酸二氢钾粉末、次氯酸钠溶液、CGS21680购自美国Sigma公司；终浓度为0.01mol/L的PBS溶液备用；次氯酸配置：166μl次氯酸钠溶液（含2.6%的活性氯）加入11.1ml磷酸二氢钾溶液（100mmol/L）中，混合后备用；CGS21680配置：100μg CGS21680溶于10ml PBS溶液中，配置成终浓度10μg/ml备用。HYP试剂盒购自南京建成生物工程研究所。AOPP酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、GSH ELISA试剂盒购自上海博蕴生物科技有限公司。LEICA DM 1000光学显微镜购自德国莱卡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色和马松染色 常规制作肺组织切片行HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变；进一步行马松染色，胶原纤维呈亮绿色，肌纤维呈红色，以亮绿色（胶原纤维）为阳性，反映胶原含量，观察纤维化情况。HE染色切片和马松染色切片采用LEICA DM 1000光学显微镜采图。

1.3.2 HYP含量测定 根据ELISA试剂盒操作步骤测定各组小鼠肺组织HYP的含量，间接反映胶原纤维含量。

1.3.3 血清及肺组织AOPP及GSH测定 根据ELISA试剂盒操作步骤测定各组小鼠的血清及肺组织AOPP及GSH含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组数据均进行Shapiro-Wilk正态性检验，结果符合正态分布。多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠HE染色肺部病理学变化及马松染色肺部胶原含量变化的比较

与WN组小鼠比较，WM组小鼠肺部呈现肺泡间隔增厚，伴炎症细胞渗出，部分肺泡萎缩粘连，血管周围胶原沉积增多。WMC组小鼠肺部上述变化较WM组小鼠减轻，见图1、图2。

图1 肺部病理学变化（HE染色，×100）

图2 肺部胶原含量的变化（马松染色，×100）

2.2 各组小鼠肺组织中HYP含量的变化

WM组小鼠肺组织中HYP含量较WN组小鼠明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；WMC组小鼠肺组织中HYP含量较WM组小鼠降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 各组小鼠肺组织中HYP含量的变化（±s，μg/mg，n=8）

表1 各组小鼠肺组织中HYP含量的变化（±s，μg/mg，n=8）

注：与WM组比较，*P<0.01

组别 肺组织中HYP含量 统计值 P WN组 0.43±0.09*WM组 0.58±0.05 12.13 <0.001 WMC组 0.50±0.04*

2.3 各组小鼠的血清AOPP含量比较

WM组小鼠的血清AOPP含量较WN组小鼠明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；WMC组小鼠的血清AOPP含量较WM组小鼠降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

表2 各组小鼠的血清AOPP含量比较（±s，nmol/ml，n=8）

表2 各组小鼠的血清AOPP含量比较（±s，nmol/ml，n=8）

注：与WM组比较，*P<0.01

组别 血清AOPP含量 统计值 P WN组 11.08±1.55*WM组 14.77±1.30 14.04 <0.001 WMC组 12.23±1.42*

2.4 各组小鼠肺组织AOPP含量的比较

WM组小鼠肺组织中AOPP含量较WN组小鼠明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；WMC组小鼠肺组织中AOPP含量较WM组小鼠降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

表3 各组小鼠肺组织AOPP含量的比较（±s，nmol/mg，n=8）

表3 各组小鼠肺组织AOPP含量的比较（±s，nmol/mg，n=8）

注：与WM组比较，*P<0.01

组别 肺组织AOPP含量 统计值 P WN组 0.36±0.08*WM组 0.56±0.05 15.62 <0.001 WMC组 0.45±0.08*

2.5 各组小鼠肺组织中GSH含量的比较

WM组小鼠肺组织中GSH含量较WN组小鼠明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；WMC组小鼠肺组织中GSH含量较WM组小鼠升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

表4 各组小鼠肺组织中GSH含量的比较（±s，μg/mg，n=8）

表4 各组小鼠肺组织中GSH含量的比较（±s，μg/mg，n=8）

注：与WM组比较，*P<0.01，#P<0.05

组别 肺组织GSH含量 统计值 P WN组 2.50±0.44*WM组 1.89±0.23 8.45 0.002 WMC组 2.14±0.12#

3 讨论

硬皮病是一种至今病因尚未完全明确的全身性结缔组织病，以自身免疫异常、各组织器官胶原过度沉积和微血管损伤为特征[12-13]。SSc-ILD是硬皮病最常见内脏器官病变之一，通常表现为肺部的炎症浸润或纤维化形成，也是硬皮病患者最常见的死亡原因之一[14]。目前尚缺乏对SSc-ILD的有效治疗。

越来越多的科学研究运用次氯酸诱导的硬皮病模型进行相关疾病发生及药物作用机制的研究[15-16]。研究发现氧化应激参与SSc-ILD的发生、发展，系统性氧化应激水平的变化通过循环系统导致肺部氧化应激水平随之变化，进而导致肺组织中激活的成纤维细胞产生大量ROS，促使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，导致a-平滑肌肌动蛋白表达增加，Ⅰ型胶原蛋白合成增加，细胞外基质沉积增多，最终导致SSc-ILD的发生发展[10,17-19]。AOPP作为一个循环因子，参与硬皮病模型中氧化应激从皮肤传播到肺的过程[18]。AOPP属于大分子尿毒症毒素，于1996年在慢性肾衰竭患者的血浆中首次发现并报道，是血清白蛋白等被ROS氧化后产生的代谢产物[20]。作为氧化应激的代谢产物，AOPP被认为是反映氧化应激损伤的敏感指标，也发挥着炎症介质的作用，可引起炎症细胞聚集，诱导产生更多的ROS，从而加重氧化应激，促进炎症反应的发生发展[21-22]。慢性肾脏病的研究发现血清AOPP的升高可诱导肾脏AOPP的增加及转化生长因子β1的表达增加，最终促成肾脏纤维化[23]。使用硬皮病患者的血清孵育成纤维细胞的实验发现AOPP可诱导其产生过氧化氢和一氧化氮，提示AOPP诱导产生不同类型的ROS参与SSc-ILD的发生、发展[24]。本研究模型中发现造模组小鼠肺组织呈现炎症及纤维化，HYP含量升高，间接提示胶原纤维含量增加；此外造模组小鼠的血清及肺组织中AOPP含量均升高，而代表抗氧化能力的GSH含量降低，提示氧化还原失衡参与SSc-ILD的发生、发展。

腺苷是机体内的一种内源性嘌呤核苷，在人体各系统广泛分布，通过其特异性细胞表面受体发挥不同生物学效应[25]。A2aR属于腺苷受体之一，被证实与氧化应激反应关系密切[9]。在多种疾病模型中发现A2aR可降低相应器官或细胞的氧化应激水平，也可提高相应细胞的抗氧化能力，产生抗氧化损伤作用[26-27]。A2aR的抗炎、抗纤维化作用也在多种疾病模型中得到证实，A2aR的激活抑制炎症细胞的聚集和炎症细胞因子的释放，最终延缓从炎症到纤维化的进展[28-30]。在亨廷顿舞蹈病中，A2aR的激活可降低神经元的DNA损伤和氧化应激诱导的细胞凋亡[31]；且在胶原诱导的关节炎模型中，A2aR的激活可降低氧化损伤水平，从而在慢性炎症过程中产生抗炎和缓解组织损伤的保护作用[32]。本研究发现A2aR激动剂组小鼠的肺组织炎症及纤维化程度较造模组减轻，代表氧化应激水平的血清及肺组织AOPP含量减少，而代表抗氧化能力的GSH含量升高。提示A2aR的激动可通过减轻硬皮病系统性氧化应激水平间接减少肺部ROS的产生，从而调节肺部氧化还原的平衡，减轻肺部的氧化应激水平，最终延缓SSc-ILD的发生、发展。

综上所述，A2aR的激活可通过抗氧化作用，有效减轻SSc-ILD的炎症和纤维化程度，延缓其发生、发展。本研究结果可能为今后开发A2aR相关药物治疗SSc-ILD提供一定的实验基础。