川芎嗪对阿尔茨海默病小鼠神经的保护作用

肖寒露 何超芹 周百桂 章娟娟

[摘要] 目的 探討川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）对阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）小鼠海马神经组织的保护作用。方法 以C57BL/6小鼠作为对照组，APP/PS1双转基因小鼠作为模型组、TMP低、中、高剂量组灌胃20、40、60mg/kg TMP，1次/d，连续30d。Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆和空间探索能力，酶联免疫吸附法检测小鼠海马神经组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10、β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）1-40、Aβ1-42、β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）含量。结果 与对照组比较，模型组内平均逃避潜伏期延长，平台停留时间、跨平台次数、SOD活性、GSH-Px活性降低（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量上升（P<0.05）。与模型组比较，TMP低、中、高剂量组小鼠平均逃避潜伏期缩短，平台停留时间、跨平台次数、SOD活性、GSH-Px活性上升（P<0.05），MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低（P<0.05）。结论 TMP能改善AD小鼠学习记忆能力，减轻海马神经组织氧化应激和炎症反应，减少Aβ含量。

[关键词] 川芎嗪；阿尔茨海默病；氧化应激；炎症反应；Aβ水平

[中图分类号] R749.16      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.022

Tetramethylpyrazine protects neural in mouse model of Alzheimers disease

XIAO Hanlu1， HE Chaoqin1， ZHOU Baigui2， ZHANG Juanjuan1

1.Department of Pharmacy， Zhejiang Jinhua Guangfu Tumor Hospital， Jinhua 321000， Zhejiang， China; 2.Department of Neurology， Zhejiang Jinhua Guangfu Tumor Hospital， Jinhua 321000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To explore the protective effect of tetramethylpyrazine （TMP） on hippocampal neural tissue in Alzheimers disease （AD） mice. Methods The C57BL/6 mice were used as the control group， the APP/PS1 double transgenic mice were used as the model group， and the TMP low， medium and high dose groups were given intragastric administration of 20， 40， and 60mg/kg of TMP， once a day for 30 consecutive days. Morris water maze test was used to detect the learning and memory and space exploration ability of mice. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect superoxide dismutase （SOD） activity， glutathione peroxidase （GSH-Px） activity， malonaldehyde （MDA） content， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL-）-1β， IL-10， β-amyloid protein （Aβ）1-40， Aβ1-42， β-amyloid precursor protein （β-APP） content in mouse hippocampal nerve tissue. Results Compared with the control group， the escape latency of the mice in the model group was prolonged， and the platform residence time， the times of cross-platforms， SOD activity， and GSH-Px activity were reduced （P<0.05）， MDA content， TNF-α， IL-1β， IL-10， Aβ1-40， Aβ1-42， β-APP content were increased （P<0.05）. Compared with the model group， the escape latency of mice in the low， medium， and high dose groups of TMP was shortened， and the platform residence time， cross-platform times， SOD activity， and GSH-Px activity were increased （P<0.05）， MDA content， TNF-α， IL-1β， IL-10， Aβ1-40， Aβ1-42， β-APP content increased （P<0.05）. Conclusion TMP can improve the learning and memory ability of AD mice， reduce the oxidative stress and inflammation of hippocampal nerve tissue， and reduce the content of Aβ.

[Key words] Tetramethylpyrazine; Alzheimers disease; Oxidative stress; Inflammatory response; Aβ level

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种起病隐匿的中枢神经系统疾病，临床症状主要为认知障碍、执行能力障碍、失语等[1]。AD的主要病理特征包括细胞外间隙β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积形成的老年斑、异常磷酸化的Tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结、神经炎症、神经元突触丢失和线粒体损伤[2]。因此AD可通过改善认知功能、清除氧化自由基、提高活性氧表达、抑制炎症因子分泌、减少Aβ形成及沉积等多种途径防治AD的发展[3]。β淀粉样蛋白毒性学说对AD的发病、发展起到重要作用，也是AD发病的中心环节[4]。

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）是一種钙拮抗剂，从中药材川芎中提取的主要活性物质之一，具有抗氧化、抗炎、降血栓、抗凋亡、抗纤维化和抗肿瘤等作用，且在神经退行性疾病AD、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和多发性硬化及心脑血管疾病中起重要作用[5]。已有研究证明，TMP对AD具有良好的治疗作用，能够减轻AD小鼠神经元凋亡、氧化损伤和炎症损伤，减少AD功能障碍[6]。但TMP对APP/PS1双转基因小鼠的研究机制尚不清楚。本研究以APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，探讨TMP对AD模型小鼠海马神经组织保护和Aβ水平作用及其相关机制，旨在为AD的研究提供实验依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  主要试剂  TMP（浓度≥98%，批准文号：国药准字H20057041，生产单位：江苏永健医药，规格：2ml∶40mg）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Aβ1-40、Aβ1-42、β-淀粉样前体蛋白（beta-amyloid precursor protein，β-APP）检测试剂盒（上海一研生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、显色剂（北京索莱宝科技有限公司）。

1.1.2  实验动物  5月龄SPF级APP/PS1双转基因小鼠40只，实验动物合格证号：SCXK（京）2014-0004。同月龄C57BL/6小鼠10只（北京华阜康生物科技股份有限公司）。实验动物饲养于本实验室，自由饮水、进食，室温23～26℃，湿度50%～70%。所有小鼠适应1周后进行实验，本研究经浙江金华广福肿瘤医院伦理委员会批准（伦理审批号：20-085）。

1.2  方法

1.2.1  小鼠的分组及处理  C57BL/6小鼠作为对照组，APP/PS1双转基因鼠分为模型组、TMP低、中和高剂量组，分别灌胃20、40、60mg/kg TMP，对照组和模型组灌胃0.2ml生理盐水，1次/d，连续30d。

1.2.2  Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力  给药30d后，开始进行Morris水迷宫实验。实验5d完成，从第1天开始训练小鼠，训练时将小鼠头部面向池壁放入水内，记录小鼠找到平台的时间即为逃避潜伏期，90s内小鼠未找到平台，可直接将小鼠引至平台。第5天定位实验结束后，将平台撤出，在标记的特定位置将小鼠放入水中，观察小鼠90s内在原平台停留时间、跨平台次数。

1.2.3  ELISA检测海马神经组织SOD活性、GSH-Px活性、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量  将海马神经组织剪碎，加入磷酸盐缓冲液，4℃ 12000转/min离心5min收集上清液，按照酶联免疫吸附实验检测试剂盒说明书步骤进行，采用酶标仪检测对应波长处的光密度值，并依据相应的标准曲线计算MDA含量、TNF-α、IL-1β、IL-10、Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP。

1.3  统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行处理及分析，计量资料均符合正态分布并以均数±标准差（）表示，两两比较采用t检验。计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  TMP对AD小鼠逃避潜伏期的影响

与对照组比较，模型组平均逃避潜伏期延长（P<0.05）；与模型组比较，TMP低、中和高剂量组平均逃避潜伏期均缩短（P<0.05），5组小鼠运动距离、平均速度比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.2  TMP对AD小鼠空间探索能力的影响

与对照组比较，模型组平台停留时间、跨平台次数降低（P<0.05）；与模型组比较，TMP低、中和高剂量组平台停留时间、跨平台次数均增加（P<0.05），见图2。

2.3  TMP对AD小鼠海马神经组织氧化应激的影响

与对照组比较，模型组海马神经组织中SOD活性、GSH-Px活性显著降低（P<0.05），MDA含量增加（P<0.05）；与模型组比较，TMP低、中和高剂量组海马神经组织中SOD活性、GSH-Px活性均显著增加（P<0.05），MDA含量均降低（P<0.05），见图3。

2.4  TMP对AD小鼠海马神经组织炎症反应的影响

与对照组比较，模型组海马神经组织TNF-α、IL-1β、IL-10含量增加（P<0.05）；与模型组比较，TMP低、中和高剂量组海马神经组织TNF-α、IL-1β、IL-10含量均降低（P<0.05），见图4。

2.5  TMP对AD小鼠海马神经组织中Aβ含量的影响

与对照组比较，模型组海马神经组织Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量增加（P<0.05）；与模型组比较，TMP低、中和高剂量组海马神经组织Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量均降低（P<0.05），见图5。

3  讨论

AD是一种广泛、进行性、不可逆及破坏性的神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因，血管疾病、吸烟、高血压、糖尿病、高胰岛素血症和神经炎症被证实会增加患临床AD的风险[1]。AD的病因尚不明确，主要有氧化应激学说、Aβ毒性学说、神经凋亡学说及基因突变学说，其中Aβ毒性学说是主流学说[7]。

Morris水迷宫实验广泛用于学习记忆、老年痴呆、神经生物学、动物心理学等多个领域，可用来研究动物的空间记忆和学习能力，在验证神经认知障碍的啮齿动物模型中發挥重要作用[8]。氧化应激是神经退行性疾病包括AD的主要病理过程，AD患者氧化应激相关的活性氧过量产生导致膜损伤、细胞骨架改变和细胞死亡，对大脑中的脂质和蛋白质造成不利影响，影响认知和大脑功能[9]。MDA是ROS造成生物膜脂质氧化过程中产生的，是氧化应激生物标志物，能够反映机体脂质过氧化强度和速率，可以间接反应氧化损伤程度；SOD、GSH-Px是清除自由基抗氧化物的关键酶，能够保护机体氧化自由基免受损伤，因此SOD和GSH-Px活性可反映清除自由基能力，作为检测氧化应激的生物学指标[10]。炎症反应是人体的一种防御机制，是抵抗损伤和感染的重要生理和病理过程，在各种神经系统疾病包括AD中炎症反应起重要作用。在AD人类和动物脑组织周围炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-10过度释放，引起神经组织炎症浸润，导致中枢神经系统炎症损伤[11]。本研究结果显示，模型组小鼠平均逃避潜伏期延长，而小鼠平台停留时间、跨平台次数降低，神经组织内SOD活性、GSH-Px活性降低，促进MDA含量，炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10含量分泌增加，提示AD模型构建成功。

中医药在预防和治疗AD方面，具有毒性低、易于穿越血–脑脊液屏障和多种协同作用等优点。中药川芎含有多种活性，临床多用于治疗心脑血管、肾脏等疾病，TMP是天然药物川芎生物碱类化合物。现代药理实验表明，其具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、调节自噬、心血管保护和神经保护等作用[12]。TMP对神经疾病有很好的保护作用。Michel等[13]研究发现TMP可减轻鱼藤酮诱导的PD大鼠神经生物学和行为缺陷且具有抗凋亡、抗炎和抗氧化作用。Lu等[14]研究发现TMP对甲基苯基四氢吡啶诱导的PD大鼠多巴胺能神经元有神经保护作用。TMP与AD发病机制有关，可以通过增强线粒体生物合成、保护兴奋性毒性、阻断钙通道和防止氧化应激诱导的神经元死亡，减少AD发生。Weng等[6]研究发现TMP可通过抑制Cullin 4B表达和生长抑素受体4泛素化降解，减轻神经元凋亡和损伤，提高AD小鼠的认知能力；Zhang等[15]研究发现TMP治疗可显著减弱同型半胱氨酸诱导的Tau过度磷酸化和Aβ积累，对AD大鼠的神经病变有保护作用。本研究结果显示，TMP能改善AD模型小鼠的学习记忆能力，减轻海马神经组织氧化应激和炎症，与文献研究结果相似，为TMP在AD治疗提供新的途径[5-13]。

Aβ毒性学说认为是由于人脑皮质和边缘区域中Aβ斑块的细胞外聚集和由过度磷酸化的τ蛋白构成的细胞内NFT，导致神经细胞凋亡，诱导氧化应激，激活小胶质细胞诱导中枢神经系统炎症，诱导神经元钙离子稳态失衡，降低细胞膜流动性，引发中枢神经系统产生退行性病变[16]。而Aβ聚集的发生是由于APP被β-分泌酶和γ-分泌酶的差异切割，导致细胞外Aβ1-40和Aβ1-42的释放产生不溶性Aβ原纤维，纤维聚集成斑块导致激酶激活，从而引起微管相关蛋白过度磷酸化，最终聚合成不溶性NFT[17]。斑块和缠结致使周围的小胶质细胞募集，诱发小胶质细胞活化和局部炎症，并发展为神经毒性。Aβ诱导的神经元损伤是多维度、多机制的，在AD脑组织内，Aβ大量累积，易发生纤维化，产生大量的ROS，破坏神经细胞元内部环境，对神经元细胞产生毒性作用，造成神经元调亡，导致突触受损，出现认知功能障碍和认知缺陷[18]。TMP作为潜在的抗氧化剂可抑制自身诱导的Aβ聚集，Weng等[6]发现TMP在减轻AD认知障碍的同时降低Aβ水平和Tau磷酸化；刘长安等[19]研究发现TMP能有效抑制AD大鼠神经元ROS生成，抑制炎症因子释放，改善炎症，降低Aβ的神经毒性，对AD大鼠起神经保护作用；Zhang等[20]发现TMP类似物T-006通过抑制AD病转基因小鼠中Tau表达和磷酸化来缓解认知缺陷。本研究结果显示，模型组内Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP过量累积，经过TMP灌胃APP/PS1双转基因小鼠，Aβ1-40、Aβ1-42、β-APP含量降低，说明TMP能减少AD模型小鼠海马内Aβ生成，与上述文献结果类似。

综上所述，TMP能改善AD模型小鼠的学习记忆能力，减少神经组织氧化应激、炎症反应和Aβ生成，起到保护神经的作用。

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（收稿日期：2022–08–31）

（修回日期：2023–07–28）