细菌对消毒剂耐药的机制及交叉耐药研究进展

毛鑫亮 许兆军 朱梦雅

1.宁波大学医学院附属宁波市第二医院，浙江宁波 315000；2.中国科学院大学宁波华美医院，浙江宁波 315000

抗生素的发现与应用，使得很多以往被认为是致命性的感染相关性疾病得到了治愈，从而提高了人类的预期寿命。如今，由于医疗卫生、畜牧兽医等多个领域对抗菌药物的滥用和不合理使用，导致多种耐药菌出现和播散，导致了感染相关性疾病的发病率和死亡率再次增加。然而，细菌耐药现象并不局限于抗菌药物。从Chaplin首次发现并报道细菌存在消毒剂耐药性，到Qac、SMR 等消毒剂耐药基因的证实与发现，越来越多的研究者开始认识到，与抗生素耐药一样，消毒剂对细菌存在耐药现象。这种耐药现象在双胍类、醛类、季铵盐类、酚类、碘类、醇类等多种消毒剂上均有所发现。本文基于国内外众多学者的相关研究报道，归纳阐述消毒剂导致细菌耐药的机制及交叉耐药现象，为进一步的科学研究提供相关理论依据。

1 消毒剂耐药的定义

目前存在多个关于细菌对消毒剂耐药的描述与定义。普遍认为当常规浓度的消毒剂对细菌失去了本应具有的杀菌、抑菌能力时，即认为消毒剂产生了耐药。亦有研究提出通过与标准菌株比较最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）或最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）来判断细菌是否对消毒剂存在耐药性。

2 消毒剂耐药的判定与检测方法

抗生素的耐药性可通过采用MIC 联合辅助纸片扩散法进行监测，通过国际标准进行耐药分析。对于消毒剂，目前国内外尚无统一的耐药定义标准，同时细菌对消毒剂敏感性的监测也无一致性评价方法。国内学者多采用MIC 或MBC 对比法来判断耐药性。随着分子生物学的快速发展，国外学者多采用基因检测来判断细菌对消毒剂的耐药性，目前发现的消毒剂抗性基因很少，如Qac、SMR 基因序列。国内多通过采用PCR 扩增检测体系对国外报道的消毒剂耐药基因进行相关检测来进行耐药分析。

3 消毒剂耐药产生的原因和机制

3.1 耐药产生的原因

医院工作中需要广泛使用消毒和灭菌等手段来预防和控制医院感染。与抗生素滥用导致的耐药一样，消毒剂也发生了类似的耐药现象。消毒方法不规范、有效浓度偏低或过高、作用时间不够、不注意使用有效期、长期使用单一消毒剂等问题，均可导致细菌对消毒剂产生耐药。

3.2 耐药机制

消毒剂与抗生素均具有杀灭或抑制微生物的作用，在作用机制和耐药机制上存在相似性。目前细菌对消毒剂耐药的机制可分为固有耐药（包括生物膜、细菌外部细胞层、主动外排系统、药物降解酶等）、诱导性耐药（包括生理适应、基因突变等）和获得性耐药（包括质粒、转座子、整合子等）。通过以上一系列机制，消毒剂或被膜阻拦在外，或被酶灭活、修饰或排出，或细菌激活自身DNA 损伤诱导反应来修复和适应消毒剂的作用。

3.2.1 固有耐药 ①生物膜：是微生物及其分泌物积累形成的聚集体。它们作为一个屏障，为微生物生命活动创造稳定的内部环境。生物膜通过限制消毒剂扩散的作用达到对消毒剂耐药的效果。例如Akinbobola等发现在浓度为2000mg/kg的过氧乙酸处理下，内镜腔内积聚的铜绿假单胞菌生物膜可存活96min，导致消毒剂失去效力。与单细胞细菌比较，生物膜在多种细菌中可起到协同作用，多种细菌的优势菌株可以保护其他菌株免受消毒剂的侵害；与协同作用相反，某种病原体生物膜的形成也可能会受到其他细菌的抑制，Gutiérrez-Almada 等发现部分海洋细菌产生抑制了一种或多种菌株生物膜形成的物质。②细菌外部细胞层：无论是细胞壁还是细胞膜，它们都起着屏障保护的作用，阻止消毒剂的渗透。细胞壁和细胞膜渗透性的下降会降低或阻止消毒剂进入细菌。革兰阴性菌因其细胞壁结构较为复杂，从而不易被消毒剂渗透破坏。③主动外排系统：目前已知有大量的膜蛋白参与了细菌对有害物质的外排，这些膜蛋白组成了主动外排系统。外排系统可能是细菌面对杀菌药物威胁反应最快和最有效的耐药机制。多个外排泵可共同，或与其他耐药机制协同抵抗消毒剂的破坏。主动外排系统可分为5个膜蛋白家族，分别是耐药瘤细胞分裂家族（resistance-nodulation-division family，RND）、主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）、多重药物及毒物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）、小多重耐药家族（small multidrug resistance family，SMR）、ATP 结合盒家族（ATP binding cassette transporters，ABC）。其中，RND 最常见于革兰阴性菌，如RND 家族中的TriABC 被发现于铜绿假单胞菌，是针对三氯生（triclosan，TCS）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）的特异性外排泵；家族中的甲基二乙醇胺[N-Ethyl-1-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2-propylamine;methylenedioxyethylamphetamine，MDEA]可在葡萄球菌表达呈现，参与了季铵盐类消毒剂外排。④药物降解酶：细菌和杀菌剂的相互作用可使细菌产生具有降解杀菌剂作用的酶，这种抗性机制包括抗重金属和抗甲醛等。此类耐药基因可位于细菌不同部位，染色体内的基因与其固有性耐药相关，亦可由诱导产生，质粒内的基因可通过传递而传播。

3.2.2 诱导性耐药 ①生理适应性耐药：低浓度消毒剂的长期作用，可使细菌耐受性发生相应的变化。但这种耐药性常发生在消毒剂浓度远低于正常使用浓度时，而且其耐药性是可逆的，往往随着作用条件的去除而消失。②基因突变或耐药基因表达增加：消毒剂及其他因素环境亦可提高细菌基因突变的发生率。其突变可发生在耐药基因上，也可发生于控制耐药基因的调控基因片段。③选择压力：严格意义上来讲，选择压力并不是细菌个体层面上出现的诱导性耐药。面对药物选择作用，细菌个体发生优胜劣汰，从而导致细菌群落对消毒剂的耐药性整体增强。同时，消毒剂的使用不当或滥用均会加剧细菌耐药性的发生。

3.2.3 获得性耐药 消毒剂耐药基因的存在与表达决定了细菌对消毒剂的耐药性。而这些耐药基因按位置不同可分为两类，分别由染色体和质粒介导。受体细菌通过各种途径获得其他细菌的耐药基因引起的消毒剂耐药即为获得性耐药，其中，质粒传递是其主要途径。Qac 基因家族在消毒剂耐药质粒的相关研究中较为常见，其又分为QacA、QacB、QacC、QacD、QacE、QacF、QacG、QacH、QacJ、QacZ 和Sugar（p）等多个亚型，表达多种化合物外排泵。QacA 或QacB 耐药基因常见于葡萄球菌，最新研究发现携带QacA 的结合质粒可以从革兰阳性菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌转移到革兰阴性菌大肠杆菌C600 中，从而导致大肠杆菌对相应消毒剂的敏感性显著降低。

其他途径可见于转座子和整合子。转座子内的基因片段，可通过质粒传递或染色体呈现，或直接在菌株间转移。整合子-基因盒系统可位于染色体，亦可出现在转座子或质粒中，前者导致了子代的耐药遗传，后者引起细菌间的耐药传播。另外，耐药基因还可通过噬菌体从一种细菌转移到另一种细菌而发生耐药性传播。

4 消毒剂的交叉耐药的定义与机制

国内外对微生物交叉耐药的定义并没有统一，交叉耐药在国内一般泛指广义的交叉耐药，包含了国外学者的狭义交叉耐药与共耐药。狭义的交叉耐药，是指属于同一类的不同抗生素或抗菌药物因为具有相同的耐药机制而出现类似的耐药；共耐药是因为同一可移动基因元件（mobile genetic elements，MGES）如质粒、转座子、整合子等携带对不同类抗菌药物的耐药基因，其发生突变或传播时，不同作用机制的不同类药物同时表现为耐药；另外，即使抗菌药物及消毒剂不属于同一类，其各类耐药机制也可能存在共通性。本文交叉耐药为广义交叉耐药。

外排泵是引起交叉耐药的常见机制。一种外排泵能排多个不同类型的抗菌化合物，这致使细菌在各类抗菌化合物之间产生交叉耐药。目前发现了多种同时引起消毒剂和抗生素耐药的外排泵系统。染色体上和质粒都可能存在这类耐药基因。以金黄色葡萄球菌为例，其染色体基因编码的家族外排泵NorA，在外排喹诺酮类抗生素的同时，也能外排季铵盐类消毒剂。其质粒介导的耐药基因Qac，各亚型可以编码产生不同外排系统家族的外排蛋白。研究发现相较非耐药菌株，头孢西丁、环丙沙星和四环素等耐药菌株的Qac 基因明显增高，可能与多种耐药基因位于同一个质粒上产生共耐药相关。

另外，由于菌株或者群落具有特殊的屏障结构，如生物膜、外膜蛋白为细菌提供了额外的保护，或细胞壁和细胞膜发生了结构功能上的改变导致通透性下降，这些非特异性抗药都是产生交叉耐药的重要原因。相较于游离菌，有生物膜存在的细菌，其耐药基因的表达会明显升高。

同时，国内外对消毒剂与抗生素耐药性的关联性方面亦存在不同看法及报道。Roedel 等对食品生产设备中分离得到的单核细胞增生李斯特菌株进行消毒剂和抗生素敏感性的检测，并未发现两者耐药性方面存在关联性。

5 小结与展望

细菌具有很强的适应能力，可以随着环境变化及抗生素、消毒剂的广泛运用，通过上述系列机制不断发生进化。而这种进化使得细菌对抗生素及消毒剂产生了耐药及交叉耐药，导致临床工作所面临的挑战更具复杂性。现今普遍认为，消毒剂的滥用、处理不当以及用量不足等是导致上诉耐药现象的主要原因。

目前，国内外对消毒剂种类的研究有限，所选细菌的代表性不够强，其耐药产生的机制尚未研究透彻，对消毒剂耐药性的判定也未统一建立。上述问题都将成为进一步研究及标准建立的重点。目前研究的消毒剂种类多集中在物体表面消毒剂，此类消毒剂可通过浸泡、擦拭、喷洒等多种方式作用于家庭或医疗场地等公共环境物体表面。其理化性质及药物浓度对人体存在危害性，如何选择合适的皮肤或创面医用消毒剂作为研究用药对象，将更具临床意义。加强细菌对消毒剂耐药性机制及交叉耐药的研究，如通过进一步的试验设计，研究比较抗生素耐药菌株与非耐药菌株对特定消毒剂耐药性的差别，了解消毒剂与抗生素耐药相关程度。随着研究的深入及数据的支持，与抗生素耐药检测与判读一样，消毒剂耐药性的检测与判定也将建立起统一的标准方案，进而为消毒剂及抗生素的临床合理选择提供更全面的思路与依据，同时还可以为新型消毒剂的研发提供相应理论支持。