HPV E6/E7 mRNA 及病毒载量检测对ASCUS 患者分层及疾病进展的预测价值

白 萍 李巧云

郑州大学第五附属医院妇科，河南郑州 450000

目前，宫颈癌位居女性因癌症死亡的第4 位。在我国，宫颈癌已成为威胁女性健康的第二大恶性肿瘤，具有发病年龄年轻化且发病率逐步上升的特点。宫颈液基薄层细胞（thinprep cytologic，TCT）检测是筛查宫颈癌及高级别病变的主要方法，其中，对于非典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）的诊治目前仍然存在争议。ASCUS 患者的细胞学特征为虽存在鳞状上皮的异常，但诊断为上皮内病变的证据不足，因此，其组织病理学的差异很大。目前主要是根据人乳头瘤病毒（human papillionma virus，HPV）DNA 的结果进行ASCUS 患者的分流，由于HPV DNA 存在假阳性率高及特异性低等问题，使得该类患者的阴道镜转诊率及活检率居高不下，造成了过度治疗，增加了患者的经济和心理负担。E6 基因通过掌握细胞周期位点，允许病毒DNA 进行非循环复制；E7 基因主要是掌控细胞周期G1、S 期，在病毒扩增阶段，病毒拷贝数扩增，E6 及E7 基因表达的mRNA 可以被有效检测出来。因此，HPV E6/E7 mRNA 有望成为目前最有希望的宫颈癌标志物。本研究选取了198例经TCT 筛查结果为ASCUS 患者，对其高危型HPV感染情况、HPV E6/E7 mRNA 检测及宫颈病变分级情况进行统计及分析，旨在探讨HPVE6/ E7mRNA对ASCUS 患者的分流及疾病进展的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2020 年3 月至2022 年3 月就诊于郑州大学第五附属医院妇科门诊经TCT 检验结果为ASCUS 患者 198 例，病理诊断医师依据国际 TBS（the Bethesda）分类标准做出诊断。年龄19～63 岁，平均（38.9±7.2）岁。纳入标准：①在郑州大学第五附属医院经TCT 检查初次发现为ASCUS；②性接触史≥3 年且目前未妊娠及哺乳期女性；③检查前24h内无性生活史、72h 内无阴道灌洗上药史；④无宫颈相关操作及治疗史，无其他恶性疾病及放化疗病史。本研究通过医院伦理委员会批准（伦理审批号：Y2021014），且所有患者均知晓宫颈癌筛查方法且签署相关知情同意后行阴道镜及活检。对其中活检病理为高度鳞状上皮内病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的患者统计HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 这2 种检测方法对HSIL+的检出率、诊断效能及ROC 曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC）值并进行分析；对于活检病理为HSIL-且未行相关治疗的95例患者随访1年，行ROC曲线分析2 种检测方法对疾病进展的预测效能。

1.2 方法

1.2.1 宫颈脱落细胞采集与读片 ①TCT：按照TCT使用说明书收集宫颈脱落细胞，标本采集后放入细胞保存液（宁波美生医疗器械有限公司），由医院两位病理科医师在显微镜下按照TBS 标准报告结果。②高危HPV DNA 检测：采用杭州钻柏科技有限公司生产的HPV DNA 市场检测试剂盒检测14 种高危型别（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68），含有任一种阳性即视为阳性。③HPV E6/E7 mRNA 检查：采用河南中美合资科蒂亚生物技术有限公司生产的E6/E7mRNA 试剂（支链DNA 信号扩增法），使用科蒂亚公司自产的HS 冷光仪进行检测。检测结果为拷贝数，≥1copy/ml为阳性。

1.2.2 阴道镜检查与宫颈活检 使用电子阴道镜系统，患者常规消毒铺巾，充分暴露宫颈，生理盐水清理宫颈表面多余的分泌物，将3%醋酸溶液涂抹宫颈表面，准确记录时间，观察宫颈上皮组织变化，再将浓碘涂抹于宫颈上观察着色情况，于所有可疑病变部位取样活检。对阴道镜镜下未见明显异常者，则进行常规四点活检或者行宫颈管搔刮。所取标本均由医院专业的病理科医师完成标本的制片及诊断，若结果不一致则由两位高年资医师重新阅片，必要时行相应免疫组织化学染色辅助诊断。

1.2.3 随访 根据2020 年美国阴道镜和子宫颈病理学会发布的2019 版基于风险的子宫颈癌筛查异常及癌前病变管理共识指南，进行分层处理：活检HSIL+者立即行相对应治疗；活检病理HSIL-者，1年后行TCT 及高危型HPV 检测，上述检测结果任何一项异常则行阴道镜检查及病理活检。

1.3 统计字方法

采用SPSS 25.0 统计学软件对数据进行处理分析。计数资料采用例数（百分率）[（%）]表示，组间比较采用检验。对HPV E6/E7 mRNA 拷贝数进行正态性检验，不符合正态分布采用[（，）]表示。相关性分析采用Spearman。使用ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）对HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 检查的诊断效能，以及预测效能进行描述与分析。＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈活检病理情况

纳入此次研究的198 例ASCUS 患者中，正常/慢性炎性反应117 例（59.10%）、低级别鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）39 例（19.70%）、HSIL 40 例（20.20%）、宫颈癌2例（1.01%）。其中，HPV DNA 阳性者144 例，HPV E6/E7 mRNA 阳性者120 例。符合1 年后随访条件（病理活检HSIL-）的156 例，其中失访61 例，TCT 结果正常且HPV 阴性者69 例，TCT 异常或高危型HPV阳性者26 例，行阴道镜及活检结果显示：慢性炎性反应17 例，LSIL6 例，HSIL3 例。

2.2 不同方法检测宫颈病变及HSIL+的诊断效能

HPV DNA对正常/慢性炎性反应及LSIL的阳性检出率优于HPV E6/E7 mRNA，差异有统计学意义（＜0.05）；HPV DNA 及HPV E6/E7 mRNA 对HSIL+的检出率，差异无统计学意义（＞0.05），见表1。

表1 2 种检测方法对各个级别宫颈病变检出率比较

宫颈活检病理HSIL+患者为42 例，HPV DNA 检查的特异性低于HPV E6/E7 mRNA，使用McNemar检验可见二者差异有统计学意义（＜0.05）；HPV DNA检查的敏感度与HPV E6/E7 mRNA差异无统计学意义（＞0.05），见表2。

表2 2 种检测方法对HSIL+的诊断效能比较

2.3 各级别宫颈病变患者的HPV E6/E7 mRNA 及病毒载量比较

各级别宫颈病变患者的HPV E6/E7 mRNA 的拷贝值经Spearman 秩相关分析，发现随着宫颈病变级别的进展，HPV E6/E7 mRNA 的阳性率及拷贝值与之呈正相关（=1.0，0.791，＜0.05），且各病变级别差异有统计学意义，见表3。

表3 各个级别宫颈病变患者的HPV E6/E7 mRNA 的病毒载量比较

2.4 ROC 曲线分析

2 种检测方法对HSIL+的诊断效能行ROC 曲线分析，并计算AUC，发现HPV E6/E7 mRNA 拷贝值的AUC 值为0.941，分别大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC 值0.613，诊断效能最高，具体详见图1、2。

图1 病毒载量的ROC 曲线

图2 HPV E6/E7 mRNA 及HPV DNA 定性ROC 曲线

2.5 随访1 年后疾病进展情况

1 年后进展为HSIL 患者3 位（2 位由LSIL 进展，1 位由炎性反应进展），ROC 曲线分析初次HPV DNA 检测及HPV E6/E7 mRNA 检测对1 年后病变进展的预测，发现HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值为0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，见图3。

图3 1 年后随访ROC 曲线

3 讨论

ASCUS 的细胞学特点为细胞的异型性并不能满足诊断上皮恶性病变，目前ASCUS 仅提示有高级别病变及癌变的危险，因此需要一种对ASCUS 患者最好的分层处理方法。一种或多种高危型HPV 病毒持续性的感染可能会导致宫颈癌前病变的发展。高危型HPV 的检测具有客观、灵敏度高的特点。约70%～90%的HPV 阳性女性，可通过自身免疫清除感染。但是HPV DNA 检测并不能区分患者是否持续性感染。HPV E6/E7 基因主要参与病毒 DNA 的复制、转录和凋亡等生理过程，参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。病变的严重程度通常与每种HPV 类型中的E6 和E7 癌蛋白对靶蛋白的亲和力有关：肿瘤抑制因子p53 和视网膜母细胞瘤蛋白。E6 和E7 癌蛋白还通过与细胞蛋白结合影响宿主细胞活性，是宿主宫颈上皮内瘤变发生所必需的。此外，在HPV 病毒感染初期，HPV DNA 处于游离状态，由于HPV E2蛋白的作用，抑制E6 和E7 基因转录；当HPV DNA整合到宿主细胞上，E2 基因区被破坏，对E6 和E7基因的转录抑制消失，E6 和E7 癌蛋白大量表达。此外，Bruno 等的研究发现，HPV E6/E7 mRNA是疾病进展的极好标志物。因此，临床上通过检测HPV E6/E7 mRNA 的水平间接判断患者是否为持续性感染，可良好规避HPV DNA 检测引起的一过性感染的问题。本研究发现HPV DNA 对正常/慢性炎性反应及LSIL 的检出率优于HPV E6/E7 mRNA，差异有统计学意义（=6.178，4.04，＜0.05）；HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 对HSIL+的检出率无统计学意义（=1.053，＞0.05）。但是HPV E6/E7 mRNA 的特异性及阳性预测值优于HPV DNA 检测，差异有统计学意义（＜0.05）。这与Ren 等的研究结果一致，认为HPV E6/E7 mRNA 分流ASCUS 患者特异性高，阳性预测值好，因此可作为筛查出高级别病变的更优方法，减少阴道镜的转诊率，减少过度治疗。

ASCUS 患者的HPV E6/E7 mRNA 的表达水平会随宫颈病变的级别升高而升高，能有效预测疾病进展的风险。本研究结果显示，由于E6 和E7 基因整合到宿主细胞，HPV E6/E7 mRNA 作为癌基因的直接表达产物，其阳性率会随着宫颈病变级别的进展而升高。对其HPV E6/E7 mRNA 的拷贝值进行统计与分析，发现其拷贝值会随着宫颈病变级别的进展而升高，对其阳性率及拷贝值行Spearman 秩相关分析，HPV E6/E7 mRNA 检测的阳性率及拷贝值与宫颈病变级别呈正相关（=1.0，0.791，＜0.05），且各病变级别差异有统计学意义。王玲玲等按照病理结果进行分组，发现宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅱ组及宫颈癌组的病毒载量均高于CINⅠ组，且差异均有统计学意义，并且随病变进展病毒载量随之升高，与本研究结果有一致性。

进一步对ROC 曲线进行分析，发现HPV E6/E7 mRNA 病毒载量的AUC 值为0.941，大于HPV E6/E7 mRNA 定性的AUC 值0.735 及HPV DNA 的AUC值0.613，进而得出HPV E6/E7 mRNA 病毒载量及阳性率均比HPV DNA 的诊断HSIL+的效能高。因此，对于ASCUS 患者行HPV E6/E7 mRNA 检测，若检测结果为阳性，则考虑进行阴道镜检查，可有效降低阴道镜转诊率。Ren 等、倪昌雪等和郭珍等研究对此也持有相同结果。但是本研究发现HPV E6/E7mRNA 病毒载量的AUC 值最大，这与上述研究者的结果略有不同，考虑可能进行HPV E6/E7 mRNA时，处于病毒复制活跃期，从而处于高拷贝状态，因此得到得AUC 值最大，但是仍需大样本数据进一步验证该结论。

对符合随访条件且行随访的95 例患者1 年后行HPV 及TCT 检测，上述检查任意1 项阳性者行阴道镜检查及活检，并将活检病理结果与初次HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA 结果进行对比，遂行ROC 曲线进行分析，发现HPV E6/E7 mRNA 的AUC 值为0.783，大于HPV DNA 的AUC 值0.658，因此发现HPV E6/ E7mRNA 还具有良好的预测高级别病变的效能。这与潘学景等研究结果高度一致。Pruski等的研究显示，随着年龄的增长，HPV E6/E7 mRNA 的敏感度和特异性更高，但是本研究未行年龄分层统计分析，郭珍等认为，HPV E6/E7 mRNA检测在≥45 岁年龄组和＜45 岁年龄组中分流的敏感度均为100%，在≥45 岁年龄组中分流的特异性为79.0%（95%：73.7～83.5），比＜45 岁年龄组的特异性（68.3%，95%：53.0～80.4）高，差异无统计学意义（＞0.05）。因此是否考虑对年龄≥45 岁且HPV E6/E7 mRNA 结果为阳性的患者进行干预治疗，延缓宫颈病变的进一步发展，仍有待商榷。

Brun等和Giorgi等的研究发现，HPV E6/E7 mRNA 阴性时，对HSIL 的消退具有极好的预测价值，而Brun 等在对HPV 阳性女性研究中发现，HPV E6/E7 mRNA 预测CINⅡ的消退率达到约60%。因此，对于ASCUS 患者HPV E6/E7 mRNA 结果为阴性的女性，无需进行进一步的阴道镜检查，做好随访工作，能够减少高级别病变的漏诊率，避免医疗资源的浪费。

综上所述，对于ASCUS患者，可以根据其HPV E6/E7 mRNA 的结果进行可能发生的病变的初步评估，并根据其评估结果考虑是否行阴道镜检查，最后可根据患者的HPV E6/E7 mRNA 的结果有效预测发展为高级别病变的风险，建议HPV E6/E7 mRNA 可作为一种新的方法进行ASCUS 患者的分流，减少过度诊疗及漏诊、误诊率，控制患者的疾病进展，指导临床工作。