基于高通量测序探讨参附桃红承气汤对脓毒症大鼠心肌抑制的影响

潘振亚　　王艳鹏　　赵娜　　邓旻

[摘要] 目的 基于高通量測序探讨参附桃红承气汤对脓毒症大鼠心肌抑制的影响。方法 30只Wistar大鼠随机分为模型组、实验组、对照组，每组各10只。模型组及实验组大鼠采用腹腔注射脂多糖的方法建立脓毒症模型，实验组大鼠造模前3 d至处死前给予参附桃红承气汤灌胃，模型组和对照组给予相同量的生理盐水灌胃。造模成功后12 h观察各组大鼠一般情况及死亡率，采用超声检测大鼠心功能，采用ELISA方法检测大鼠血清CK-MB、cTNI水平，电镜下观察大鼠心肌细胞结构，采用16S rDNA测序分析肠道菌群变化。结果 实验组大鼠死亡率（20%）低于模型组（30%）;实验组大鼠CK-MB及cTNI低于模型组（P<0.05），但均高于对照组（P<0.05）;在心脏超声结果方面，实验组大鼠LVEF及CO值高于模型组（P<0.05），均低于对照组（P<0.05）;电镜下实验组见少许线粒体损伤，脊线断裂较少;模型组线粒体可见较多脊断裂、模糊，并且见空泡化;在肠道菌群丰度方面，厚壁菌门表达水平模型组<实验组<对照组（P<0.05），实验组和模型组大肠杆菌-志贺菌表达量明显高于对照组，中药干预后，实验组表达量小于模型组。结论 参附桃红承气汤可以减轻脓毒症大鼠心肌损伤，改善心功能，调整肠道菌群结构。

[关键词] 参附桃红承气汤;脓毒症;大鼠;心肌抑制

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）07-0025-06

Investigation on the effect of Shenfu Taohong Chengqi Decoction on myocardial inhibition in septic rats based on high-throughput sequencing

PAN Zhenya  WANG Yanpeng  ZHAO Na  DENG Min

Department of Emergency Medicine， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou  310003， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Shenfu Taohong Chengqi Decoction on myocardial inhibition in septic rats based on high-throughput sequencing. Methods A total of 30 Wistar rats were randomly divided into the model group， the experimental group and the control group， with 10 rats in each group. The sepsis models were established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide in rats from the model group and the experimental group. The rats in the experimental group were given Shenfu Taohong Chengqi Decoction by gavage from 3 days before modeling to termination， and the model group and the control group were given the same amount of normal saline by gavage. During 12 hours upon successful modeling， the general conditions and mortality of rats in each group were observed. The cardiac function of rats was detected by ultrasound， the levels of serum CK-MB and cTnI in rats were measured by ELISA， the structure of rat cardiomyocytes was observed under electron microscope， and the changes of intestinal flora were analyzed by 16S rDNA sequencing. Results The mortality of rats in the experimental group （20%） was lower than that in the model group （30%）. CK-MB and cTnI in the experimental group were lower than those in the model group （P<0.05）， but higher than those in the control group （P<0.05）. In terms of cardiac ultrasound results， the values of left ventricular ejection fraction （LVEF） and cardiac output （CO） in the experimental group were higher than those in the model group （P<0.05） and lower than those in the control group （P<0.05）. Under electron microscope， a little mitochondrial damage and fewer broken ridges were observed in the experimental group. In the model group， there were many broken and fuzzy ridges and vacuolization seen in mitochondria. In terms of intestinal flora abundance， the expression level of Firmicutes in the model group was successively less than that in the experimental group and the control group （P<0.05）， the expression level of Escherichia coli and Shigella spp. in the experimental group and the model group was significantly higher than that in the control group， and the expression level in the experimental group was less than that in the model group after the intervention of traditional Chinese medicine. Conclusion Shenfu Taohong Chengqi Decoction can reduce myocardial injury， improve cardiac function and adjust the structure of intestinal flora in septic rats.

[Key words] Shenfu Taohong Chengqi Decoction; Sepsis; Rats; Myocardial inhibition

脓毒症是一种由感染引起机体反应失调而造成威胁生命的器官功能障碍[1]。约40%～50%的严重脓毒症患者会出现不同程度的心肌抑制[2]。研究表明，微循环障碍、心肌细胞线粒体损伤及氧化应激、促炎细胞因子、心肌细胞凋亡等因素参与心肌抑制的过程[3-7]。脓毒症发生时，原有肠道菌群多样性及丰度出现显著变化，而肠道菌群的改变与促炎细胞因子、氧化应激、能量代谢等存在密切相关性，从多方面参与心肌损伤的过程[8]。因此，通过高通量测序来探讨脓毒症心肌损伤机制成为新的思路和途径。

在前期的研究中证实，参附桃红承气汤可有效保护脓毒症大鼠的肠屏障功能[9]。因此本研究在前期实验基础上，通过高通量测序探讨参附桃红承气汤对脓毒症心肌损伤的疗效及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级WISTAR雌、雄大鼠各15只，体重180～220 g，通过浙江中医药大学动物实验研究中心订购[许可证号SYXK（浙）2018-0012]。动物实验通过浙江中医药大学动物实验研究中心伦理审查（批準编号：IACUC-20190805-07）。

1.2 实验仪器与试剂

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自于Sigma公司，肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CKMB）及肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）ELISA试剂盒购自于Elabscience公司;小动物超声系统;离心机;电子显微镜。

1.3 实验药物

参附桃红承气汤（太子参20 g，制附子10 g，桂枝10 g，桃仁10 g，红花10 g，生大黄10 g，芒硝10 g，枳实10 g，厚朴10 g，甘草10 g）由杭州市红十字会医院药剂科提供，浓煎至8 g/ml，过滤除菌分装4℃保存。

1.4 动物造模及分组

将30只Wistar大鼠随机分成模型组、实验组及对照组，每组各10只，各组大鼠之间体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）。实验组及模型组大鼠采用腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）方法建立大鼠脓毒症模型。对照组大鼠腹腔注射同等量生理盐水。

1.5 给药方法

造模前3 d开始给药，实验组给予中药1 ml灌胃，生药剂量为8 g/只，2次/d;模型组和对照组均予以0.9%氯化钠注射液1 ml灌胃，2次/d;在造模后12 h，检测大鼠各项指标后处死大鼠。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠一般情况观察  观察各组大鼠皮毛色泽、食欲、活动度、死亡情况，并做记录。

1.6.2 心功能测定  使用超声在处死前分别检测大鼠的心功能指标，如左心室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、心输出量（cardiac output，CO）等。

1.6.3 大鼠血清CK-MB、cTNI测定  大鼠在麻醉后经腹主动脉取血，采用3000 r/min进行离心15 min，取上清液，釆用ELISA试剂盒测定，按照检测试剂盒说明使用方法进行检测。

1.6.4 心肌细胞超微结构观察  各组大鼠处死后摘取心脏，取左心室约5 mm厚心肌组织，使用4%戊二醛灌注固定，再经过洗涤、固定、脱水及包埋等处理，最后经染色后在电镜下观察大鼠心肌细胞超微结构。

1.6.5 高通量测序分析  取大鼠粪便标本，利用Illumina公司Miseq平台进行高通量测序。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组数据组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般情况

实验组大鼠出现活动减少，反应减慢;模型组大鼠拱背耸毛明显，皮毛无光泽，反应明显迟钝;空白组大鼠皮毛有光泽，动作灵敏，进食正常，二便正常。空白组大鼠无死亡，实验组大鼠死亡2只，对照组大鼠死亡3只。见表1。

2.2各组大鼠心脏超声指标情况

与对照组相比，实验组与模型组LVEF及CO均出现显著下降（P<0.05），说明造模后大鼠均出现心功能减退;与模型组相比，实验组大鼠LVEF值及CO值均明显升高（P<0.05）。见表2、图1。

2.3各组大鼠CK-MB、cTNI情况

与对照组相比，实验组和模型组CK-MB及cTNI均增高，说明造模后大鼠出现心肌抑制情况。与模型组相比，实验组大鼠CK-MB及cTNI均明显减低（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠电镜情况

对照组线粒体结构完整，脊线完好无损，肌原纤维排列紧密，未见肿胀及空泡变等损害;模型组线粒体损伤较大，可见较多脊断裂、模糊，肌原纤维排列疏松，并且见空泡化;实验组可见少许线粒体损伤，脊线断裂较少，肌原纤维排列稍显疏松。见封三图2。

2.5 各组大鼠肠道菌群比较

对各组大鼠的肠道菌群组成情况进行高通量测序，共得到649个OUT、12个门、19个纲、27个目、53个科、142个属、249个种。厚壁菌门（firmicutes）包括葡萄球菌属、肠球菌属、乳球菌属、乳杆菌属等。在肠道菌群丰度方面，在门水平上可以发现厚壁菌门表达水平模型组<实验组<对照组（P<0.05）。见图2、表4。在属水平上来看，大肠杆菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）表达量在实验组和模型组明显高于对照组，可能为脓毒症大鼠特异致病菌。见图3。

3 討论

对于脓毒症患者来说，心肌损伤是常见的一种器官功能障碍，当出现心肌损伤时死亡率亦会明显增高[10]。亦有研究发现脓毒症以心肌细胞功能受到抑制为主，同时这种抑制是可逆的[11]。由此可以看出，在疾病早期应积极防治心肌损伤的出现。脓毒症所致心肌损伤机制较为复杂，其中炎症反应是主导机制之一，是导致死亡率升高的重要原因。有研究表明，脓毒症时肠道优势菌群数目减少、菌群多样性降低与全身炎症反应综合征、多器官功能障碍综合征患者的死亡风险呈正相关[12]。传统中医虽然没有脓毒症的概念，但中医在治疗外感热病、温病等方面具有丰富的临床用药经验，且现代医学亦证实中医药能够通过多环节、多层次、多靶点的整合调节作用治疗脓毒症等疾病[13]。

参附桃红承气汤是基于大承气汤加减化裁而来，由太子参、制附子、桃仁、红花、生大黄、芒硝、枳实、厚朴、桂枝、甘草等10味中药组成，具有益气补虚、化瘀行气、通腑泻下之功效，正好切中脓毒症心肌损伤的发病病机[14]。方中大黄苦寒通降、泄热通便、化瘀活血，芒硝咸寒润峻、泻热通便，二者相须为用。研究表明，大黄能抑制机体炎性细胞因子释放，阻止肠道内细菌和内毒素移位[15]，芒硝主要成分为硫酸钠，可促进肠蠕动，产生泻下通便的功能[16];桃仁、红花用于活血化瘀，可扩张血管，增加血流量，改善血液循环[17];厚朴、枳实破气消积，研究表明和厚朴酚可抑制线粒体氧化应激及其诱导的心肌凋亡，能够显著改善脓毒症心肌损伤[18];太子参补气生津，具有抗应激、抗炎、促进氧自由基清除等作用，可减少心肌损伤[19];桂枝温通心阳、助阳化气;附子回阳救逆、温中补虚，具有抑制心肌氧化反应和超氧阴离子自由基产生的作用[20]。

本研究立足于传统中医理论，并结合现代医学的相关技术手段，以肠道菌群为切入点，着力于探讨参附桃红承气汤治疗脓毒症心肌损伤的疗效及其机制。研究认为，肠道菌群可通过调节能量代谢、机体氧化应激和炎症等方式导致心血管疾病的发生[21]。本次实验结果显示，在门水平上，厚壁菌门的表达量在实验组和模型组较对照组下降明显;而在属水平上大肠杆菌-志贺菌在模型组及实验组的表达量较对照组明显增高，同时在整个菌群中的丰度也显著增高，说明脓毒症时大鼠肠道菌群多样性及丰度均发生了明显变化。同时，与空白组相比，模型组及实验组CK-MB、cTNI值均显著增加，心脏超声提示LVEF及CO值显著降低，说明造模后模型组与实验组均出现了明显的心肌损伤。研究显示，脂多糖被认为是大肠杆菌细胞壁成分中最有效的免疫刺激剂，能够被TLR4识别引起下游信号通路激活[22]。在TLR4通路激活后，通过MyD88依赖和非依赖的途径诱导炎症活化，最终产生大量的炎症因子，从而显著加重心肌损伤[23]。另一方面，在脓毒症时大鼠肠屏障功能会受损，肠道菌群及其代谢产物亦出现明显改变，而菌群代谢产物与心肌能量代谢、线粒体功能及炎症反应存在密切的相关性，脓毒症会进一步加重心肌的损伤[24]。同时本实验结果显示，经过参附桃红承气汤干预后，实验组大鼠CK-MB、cTNI值降低，同时LVEF及CO值较模型组明显升高，并且电镜下可以观察到心肌细胞线粒体损伤减少，说明参附桃红承气汤可显著减轻心肌损伤，改善心功能;在菌群调节方面，可发现经中药干预后，Escherichia-Shigella在实验组表达量低于模型组。

综上所述，参附桃红承气汤可以有效减轻脓毒症大鼠的心肌损伤，改善大鼠心功能，调节肠道菌群。

[参考文献]

[1]   Singer M，Deutschman CS，Seymour CW，et al. The third international consensus definitions for septic and septic shock（septic-3）[J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[2]   Jeong HS，Lee TH，Bang CH，et al. Risk factors and outcomes of sepsis-induced myocardial dysfunction and stress-induced cardiomyopathy in sepsis or septic shock：A comparative retrospective study[J].Medicine（Baltimore），2018，97（13）：e0263.

[3]   Charlton M，Sims M，Coats T，et al. The microcirculation and its measurement in sepsis[J].J Intensive Care Soc，2017，18（3）：221-227.

[4]   Rademann P，Weidinger A，Drechsler S，et al. Mitochon-dria-targeted antioxidants SkQ1 and MitoTEMPO failed to exert a long-term beneficial effect in murine polymicr-obial sepsis[J].Oxid Med Cell Longev，2017，2017：6412 682.

[5]   Kakihana Y，Ito T，Nakahara M，et al. Sepsis-induced myocardial dysfunction：Pathophysiology and manag-ement[J].Journal of Intensive Care，2016，4（1）：22.

[6]   Zhang B，Liu Y，Zhang JS，et al. Cortistatin protects myocardium from endoplasmic reticulum stress induced apoptosis during sepsis[J].Mol Cell Endocrinol，2015，406：40-48.

[7]   Yu HY，Yu F. Research progress on sepsis-induced cardiac autonomic nervous system dysfunction[J].Anhui Medical & Pharmaceutical Journal，2011，15（8）：931-934.

[8]   Wang Z，Zhao Y. Gut microbiota derived metabolites in cardiovascular health and disease[J].Protein & cell，2018， 9（5）：416-431.

[9]   邓旻，朱仕兵，陈志明，等.扶正祛瘀通下法对多器官功能障碍综合征大鼠肠机械屏障功能的保护及机制[J].中华中医药学刊，2017，35（12）：3160-3163.

[10]  Hochstadt A，Meroz Y，Landesberg G. Myocardial dysfun- ction in severe sepsis and septic shock：More questions than answers[J].Journal of Cardiothoracic&Vascular Anes-thesia，2011，25（3）：526-535.

[11]  Takasu O，Gaut JP，Watanabe E，et al. Mechanisms of car- diac and renal dysfunction inpatients dying of sepsis[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，187（5）：509-517.

[12]  王慧芳，王方岩，常平，等.肠道微生态与脓毒症[J].中华危重症医学杂志（电子版），2018，11（6）：415-419.

[13]  黄坡，赵国桢，陈奕杉，等.《中医药单用/联合抗生素治疗常见感染性疾病临床实践指南·脓毒症》解读与展望[J].中国中药杂志，2018，43（24）：4782-4785.

[14]  邓兆岿，阚诗云，邱占军.中医药治疗脓毒症心肌损伤的研究进展[J].中国中医急症，2018，27（7）：1296-1299.

[15]  李爱军，苗进昌，王鑫，等.大黄对肠源性脓毒症大鼠发病机制的影响[J].现代中西医结合杂志，2019，28（31）：3434-3438.

[16]  廖陆雷，陆云霞，凌玉，等.大黄芒硝汤保留灌肠治疗脓毒症合并肠功能障碍62例[J].河南中医，2019，39（2）：237-240.

[17]  聶林，张波英，王庆，等.中医健脾祛痰、活血化瘀法联合西药对肥胖型PCOS不孕症的疗效分析[J].中国现代医生，2018，56（13）：54-57.

[18]  翟蒙恩，张彬，李凯峰，等.和厚朴酚对小鼠脓毒症心肌损伤的保护作用[J].西北大学学报（自然科学版），2018， 48（6）：787-792.

[19]  刘湘湘，阮君山.太子参多糖对大鼠心肌缺血的保护作用[J].中国民族民间医药，2017，26（17）：18-20.

[20]  耿姗，葛华雯，王新宇，等.附子及附子、干姜配伍对H2O2导致心肌细胞损伤的抗氧化作用[J].中国中医急症，2014，23（11）：2012-2013，2020.

[21]  Karlsson F H，Frida F，Nookaew I，et al. Symptomatic ath- erosclerosis is associated with an altered gut metagen-ome[J].Nature Communications，2012，3（1）：1915-1920.

[22]  袁雪明，刘陆滨，赵志香.内毒素脂多糖（LPS）对人牙周膜成纤维细胞TNF-α、IL-6表达的影响[J].中国现代医生，2016，54（10）：1-3.

[23]  Vijay K. Toll like receptors in immunity and inflammatory diseases：Past，present，and future[J].Int Immunopharmacol，2018，59：391-412.

[24]  郑淑芬，吴圆圆，钟诗龙.基于肠道菌群参与的冠心病色氨酸代谢通路研究现状[J].中国临床药理学杂志，2020， 36（20）：3362-3366.

（收稿日期：2021-10-13）