ALDH1A1调控Notch1信号通路在MMSCs“干性”维持中的作用和机制研究

王晓丽 江妤 曾玉晓 刘永华 章俏雷

[摘要] 目的 研究乙酰脫氢酶家族成员A1（ALDH1A1）调控Notch1信号通路在多发性骨髓瘤干细胞（MMSCs）“干性”维持中的作用和机制。 方法 选用人MMSCs CD138-B细胞和人正常干细胞QSG-7701，用Western blot法检测ALDH1A1在CD138-B细胞和QSG-7701细胞中的表达情况。将CD138-B细胞分为control组、ALDH1A1敲减组、Notch1通路抑制剂组，control组不作任何处理，ALDH1A1敲减组转染10 μg ALDH1A1-shRNA重组慢病毒质粒，Notch1通路抑制剂组加入20 μmol/L Notch1通路抑制剂GSI，培养48 h，检测并比较三组ALDH1A1表达量、Notch1通路相关蛋白[Notch1、发状分裂相关增强子1（Hes1）]表达量、增殖率、凋亡率及“干性”相关基因[胚胎干细胞关键蛋白（NANOG）、八聚体结合转录因子4（OCT4）]表达量。结果 CD138-B细胞中ALDH1A1蛋白表达量较QSG-7701细胞明显增加（P<0.05）;ALDH1A1敲减组ALDH1A1蛋白表达量较control组明显减少（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组ALDH1A1蛋白表达量与control组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。ALDH1A1敲减组和Notch1通路抑制剂组增殖率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表达量较control组明显减少（P<0.05），凋亡率较control组明显增多（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组增殖率、凋亡率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表达量与ALDH1A1敲减组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 ALDH1A1在MMSCs中呈高表达，ALDH1A1敲减后可通过阻抑Notch1信号通路下调MMSCs“干性”维持，抑制MMSCs增殖并诱导其凋亡。

[关键词] 乙酰脱氢酶家族成员A1;Notch1信号通路;多发性骨髓瘤干细胞;表达水平;干性维持;细胞增殖;细胞凋亡

[中图分类号] R733.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）07-0021-04

Study on the role and mechanism of ALDH1A1 regulating Notch1 signaling pathway in stemness maintenance of MMSCs

WANG Xiaoli JIANG Yu ZENG Yuxiao LIU Yonghua ZHANG Qiaolei

Department of Hematology， Lishui People′s Hospital in Zhejiang Province， Lishui   323000， China

[Abstract] Objective To investigate the role and mechanism of aldehyde dehydrogenase family 1 member A1 （ALDH1A1） in regulating the Notch1 signaling pathway in the stemness maintenance of multiple myeloma stem cells （MMSCs）. Methods Human MMSCs CD138-B cells and human normal stem cells QSG-7701 were selected to detect the expression of ALDH1A1 in CD138-B cells and QSG-7701 cells by Western blot. CD138-B cells were divided into the control group， the ALDH1A1 knockdown group and the Notch1 pathway inhibitor group. The control group was not treated with any treatment. The ALDH1A1 knockdown group was transfected with 10 μg ALDH1A1-shRNA recombinant lentiviral plasmid. The Notch1 pathway inhibitor group was added with 20 μmol/L Notch1 pathway inhibitor GSI and cultured for 48 h. The expression levels of ALDH1A1， Notch1 pathway related proteins （Notch1， hair division associated enhancer 1 [Hes1]）， proliferation rate， apoptosis rate and stemness related genes （embryonic stem cell key protein [NANOG]， octamer binding transcription factor 4 [OCT4]） were detected and compared among the three groups. Results The expression of ALDH1A1 protein in CD138-B cells was significantly higher than that in QSG-7701 cells （P<0.05）. The protein expression of ALDH1A1 in the ALDH1A1 knockdown group was significantly lower than that in the control group （P<0.05）. No significant difference was observed in the ALDH1A1 protein expression in the Notch1 pathway inhibitor group compared with the control group （P>0.05）. The proliferation rates and the expression levels of Notch1 and Hes1 proteins and NANOG and OCT4 genes in the ALDH1A1 knockdown group and the Notch1 pathway inhibitor group were significantly decreased compared with the control group （P<0.05）， and the apoptosis rates were significantly increased compared with the control group （P<0.05）. No significant differences were observed in the proliferation rate， apoptosis rate， and the expressions of Notch1， Hes1， NANOG and OCT4 gene in the Notch1 pathway inhibitor group compared with the ALDH1A1 knockdown group（P>0.05）. Conclusion ALDH1A1 is highly expressed in MMSCs. Knockdown of ALDH1A1 can inhibit the stemness maintenance of MMSCs by inhibiting the Notch1 signaling pathway， inhibit the proliferation of MMSCs and induce their apoptosis.

[Key words] ALDH1A1; Notch1 signaling pathway; Multiple myeloma stem cells; Expression level; Stemness maintenance; Cell proliferation; Apoptosis

多發性骨髓瘤为血液系统恶性肿瘤，发病率约为1/10万，好发于老年人群，特征是克隆性浆细胞在骨髓中恶性增生，造成相关组织或器官损伤[1]。其临床表现是贫血、骨骼损害、高钙血症、肾功能损害等[2]。目前沙利度胺、硼替佐米等新药以及造血干细胞移植在多发性骨髓瘤治疗中的应用使患者生存期有所延长，但该病伴有高风险的复发，完全治愈十分困难[3]。治疗后复发被认为与多发性骨髓瘤干细胞（multiple myeloma stem cells，MMSCs）有关，这些干细胞有肿瘤起始、自我更新及化疗药物耐药的潜能，现有干预方案可能只清除多发性骨髓瘤细胞，而对其干细胞的干预作用不明显[4]。乙酰脱氢酶家族成员A1（aldehyde dehydrogenase family 1 member A1，ALDH1A1）是干细胞标志物之一，能够促进肿瘤的发生和进展，如乳腺癌、肺癌等[5]。Notch1信号通路是一条进化上十分保守的信号通路，涉及细胞增殖、凋亡、分化、上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）及干细胞自我更新等过程，该通路异常可能导致肿瘤的形成[6]。以往研究显示[7]，ALDH1A1与肿瘤干细胞干性关系密切，但其与MMSCs干性和生物学行为的关系及机制尚不清楚。因此，本研究分析ALDH1A1调控Notch1信号通路在MMSCs干性维持及增殖、凋亡中的作用和机制，希望为临床治疗多发性骨髓瘤提供新的干预靶点，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

人MMSCs CD138-B细胞（北京埃克森科技有限公司）;人正常干细胞QSG-7701（上海雅吉生物科技有限公司）;ALDH1A1-shRNA重组慢病毒质粒（武汉维克赛思科技有限公司）;Notch1通路抑制剂GSI（上海翊圣生物科技有限公司）;CCK-8溶液（上海富衡生物科技有限公司）;PI染液、Annexin V-FITC（北京拜尔迪生物技术有限公司）;BCA蛋白定量试剂盒（上海梵态生物科技有限公司）;兔抗ALDH1A1单克隆抗体（上海群己生物科技有限公司）、兔抗β-actin单克隆抗体（武汉亚科因生物技术有限公司）;山羊抗兔IgG二抗（上海研卉生物科技有限公司）;ECL发光试剂盒（广州市智取生物科技有限公司）;兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Hes1单克隆抗体（上海嵘崴达实业有限公司）;总RNA提取试剂盒（北京伊塔生物科技有限公司）;反转录试剂盒（上海百赛生物技术有限公司）。

1.2 实验分组

将CD138-B细胞和QSG-7701细胞进行原代培养，收集其对数生长期的相应细胞，接种于6孔细胞培养板中，每孔4×105个为细胞接种密度，用DMEM培养基（含有10%胎牛血清），在37℃（5%、CO2）条件下培养，待细胞在培养基中的生长密度达80%～90%时用于以下实验。

将CD138-B细胞分为control组、ALDH1A1敲减组、Notch1通路抑制剂组，control组不作任何处理，ALDH1A1敲减组转染10 μg ALDH1A1-shRNA重组慢病毒质粒，Notch1通路抑制剂组加入20 μmol/L Notch1通路抑制剂GSI，继续培养48 h，48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，传代后，换用L15培养液[含有嘌呤霉素（2 μg/ml）]进行筛选，得到稳定传代的细胞克隆。上述过程中的转染操作按照LipofectamineTM2000转染说明书进行。

1.3 采用CCK8法检测三组CD138-B细胞增殖率

取1.2项下的三组细胞，制成单细胞悬液，以5×105/ml接种于96孔板（每孔100 μl），待细胞贴壁后加入CCK-8溶液（每孔10 μl），37℃培养120 min，用酶标仪测定570 nm波长处各孔吸光度（A）值，增殖率计算公式为[1-（处理组A/对照组A）×100%]。

1.4采用流式细胞术检测三组CD138-B细胞凋亡率

取1.2项下的三组细胞，制成单细胞悬液，加入250 μl EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）将细胞重悬，再加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI染液，避光条件下反应15 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5采用Western blot法检测ALDH1A1在CD138-B细胞和QSG-7701细胞中的表达情况

取1.2项下的CD138-B细胞和QSG-7701细胞，匀浆，裂解，离心，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度并定量，取总蛋白上样，电泳，切胶，转膜，封闭，加入兔抗ALDH1A1单克隆抗体（1∶300稀释）、兔抗β-actin单克隆抗体（1∶200稀释），4℃孵育过夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（碱性磷酸酶标记，1∶3000稀释），37℃孵育1 h，洗膜，用ECL发光试剂盒曝光显影，用Image Lab软件对目的蛋白（ALDH1A1）和内参蛋白（β-actin）的灰度值进行分析，目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值为最终结果。

1.6采用Western blot法检测ALDH1A1及Notch1通路相关蛋白[Notch1、发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）]在三组中的表达情况

取1.2项下的三组CD138-B细胞，匀浆，裂解，离心，收集上清，测定蛋白浓度并定量，取总蛋白上样，电泳，切胶，转膜，封闭，加入Notch1、Hes1一抗（1∶500稀释）及ALDH1A1一抗和β-actin一抗，4℃孵育过夜，洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h，洗膜，曝光显影，用Image Quant TL软件分析各条条带的灰度值。

1.7采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢测“干性”相关基因在三组CD138-B细胞中的表达量

取1.2项下的三组细胞，用细胞总RNA提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，然后在T100 PCR仪上进行PCR扩增。扩增体系为：1 μl cDNA模板，10 μl SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5 μl，加无核酶水将体系补充至20 μl;反应条件为：95℃条件下预变性15 s，95℃条件下变性5 s，57℃条件下复性30 s，72℃条件下延伸30 s，循环共42个;引物序列见表1。根据扩增曲线准确读取循环阈值（cycle threshold，Ct），内参照为GAPDH基因，用相对定量法以2 -△△Ct表示NANOG、八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor-4，OCT4）基因表达量。

1.8统计学方法

所有实验重复3次。采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组之间的计量资料比较用t检验，三组之间的计量资料比较用单因素方差分析（其中两两计量资料比较采用SNK-Q检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1A1在CD138-B细胞和QSG-7701细胞中的表达情况

与QSG-7701细胞（0.74±0.16）比较，CD138-B细胞中ALDH1A1蛋白表达量（2.92±0.97）明显增加（t=3.841，P=0.018）。

2.2 ALDH1A1及Notch1通路相关蛋白在三组中的表达情况

ALDH1A1敲减组ALDH1A1蛋白表达量较control组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组ALDH1A1蛋白表达量与control组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。ALDH1A1敲减组和Notch1通路抑制剂组Notch1、Hes1蛋白表达量较control组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组Notch1、Hes1蛋白表达量与ALDH1A1敲减组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、图1。

2.3 “干性”相关基因在三组中的表达情况

ALDH1A1敲减组和Notch1通路抑制剂组NANOG、OCT4基因表达量较control组明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组NANOG、OCT4基因表达量与control组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 三组增殖和凋亡情况

ALDH1A1敲减组和Notch1通路抑制剂组增殖率较control组明显减少（P<0.05），凋亡率较control组明显增多（P<0.05）;Notch1通路抑制剂组增殖率和凋亡率与ALDH1A1敲减组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4、封三图1。

3 讨论

肿瘤干细胞是肿瘤形成的根源，也是肿瘤细胞对放化疗抵抗的根本[8]。降低MMSCs的“干性”对于提高多发性骨髓瘤疗效有重要意义。ALDH是一种胞质酶，能够催化乙醛氧化为乙酸，在机体代谢中具有重要作用，与肿瘤的形成存在一定关系[9]。ALDH1为ALDH家族中的重要成员，可将视黄醇氧化为视黄酸，然后与视黄酸受体-α（retinoic acid receptor-α，RAR-α）结合而参与多种组织分化和基因调控[10]。ALDH1在多种肿瘤干细胞中处于高表达状态。ALDH1A1是ALDH1的亚型之一，在结肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞中表达异常，并与这些肿瘤细胞的侵袭和转移有关[11]。相关文献报道，ALDH1A1过表达后小鼠的成瘤能力更强，且“干性”增强[12]。研究显示ALDH1A1表达水平与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移、TNM分期关系密切，而与肿瘤大小、年龄无关，ALDH1A1高表达患者的生存期缩短明显，提示ALDH1A1在乳腺癌恶性转化过程中有着促进作用，其水平检测有助于判断乳腺癌恶性程度和预后情况[13]。学者发现，ALDH1A1在喉鳞癌Hep2肿瘤细胞中呈高表达，且其高表达能够促进Hep2细胞增殖并诱导其凋亡[14]。相关报告指出，ALDH1A1表达水平升高是肺癌预后的危险因素，ALDH1A1可作为肺癌肿瘤干细胞（lung cancer stem cells，LCSCs）表面标志物[15]。本研究中，CD138-B细胞中ALDH1A1蛋白表达量较QSG-7701细胞明显增加，提示ALDH1A1在MMSCs中呈高表达，ALDH1A1可能与多发性骨髓瘤发生有关;ALDH1A1敲减组ALDH1A1蛋白表达量较control组明显减少，提示ALDH1A1-shRNA重组慢病毒质粒转染成功;ALDH1A1敲减组增殖率及NANOG、OCT4基因表达量较control组明显减少，凋亡率较control组明显增多，提示敲减ALDHlAl后可下调MMSCs“干性”维持，抑制MMSCs增殖并诱导其凋亡。

Notch1通路是存在于大部分细胞生物体中的配体-受体信号通路，在细胞生物学行为如生长、分化、代谢、增殖等中起重要作用，其在恶性肿瘤中的作用也备受关注[16]。Hes1是调控Notch1通路的关键靶基因之一，检查Hes1表达情况可判断该通路的活化程度[17]。研究显示，Notch1通路在前列腺癌中呈现高度激活状态，该通路受到抑制后可减弱肿瘤细胞的增殖能力，Notch1及下游的靶基因Hes1在卵巢癌中有异常高表达，抑制其表达后能够促进卵巢癌细胞凋亡[18]。GSI为Notch1信号第3步酶切反应，能够阻碍Notch1胞内段Nicd释放，使细胞增殖及分化受到影响[19]。文献显示，GSI能够阻断Notch1通路在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤细胞中的表达[20]。本研究用GSI抑制MMSCs中的Notch1通路，分析ALDH1A1是否通过调控Notch1通路对MMSCs干性维持及增殖、凋亡发挥作用，结果显示ALDH1A1敲减组Notch1、Hes1蛋白表达量较control组明显减少，提示ALDH1A1敲减后Notch1通路处于抑制状态;Notch1通路抑制剂组增殖率及Notch1、Hes1蛋白和NANOG、OCT4基因表达量较control组明显减少，凋亡率较control组明显增多，且上述指标在ALDH1A1敲减组和Notchl通路抑制剂组中无明显差异，提示ALDH1A1对MMSCs“干性”、增殖、凋亡的作用机制与Notchl信号通路有关。

综上所述，ALDH1A1敲减后可通过阻抑Notch1信号通路下调MMSCs“干性”维持，抑制MMSCs增殖并诱导其凋亡。但ALDH1A1对MMSCs“干性”及生物学行为是否还有其他调控机制，有待进一步研究。

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（收稿日期：2021-03-11）