脑组织中FoxO3在高压氧暴露后的蛋白表达

余雪

[摘要] 目的 探討小鼠暴露于高压氧后其中枢神经系统的反应和病理变化、FoxO3蛋白的作用及其机制及FoxO3对急性氧中毒的影响。方法 将体重24～28 g的24只小鼠随机分为FoxO3蛋白含量测定组和FoxO3 mRNA含量测定组，每组12只。FoxO3蛋白含量测定组的12只小鼠再随机分为四组，在6个绝对大气压条件下暴露30 min，0、8、24 h 分别取大脑皮层;FoxO3 mRNA含量测定组同样分组;检测FoxO3蛋白在大脑皮质的表达及定位FoxO3的位置，探讨FoxO3起作用的信号、传导途径和机制。结果 在大脑皮层中，Western blot 检测FoxO3蛋白表达中，正常组蛋白灰度值比为1.000，暴露结束后为1.128，结束后8 h为1.736，结束后24 h 为1.504，结果表明结束后8 h含量达到峰值;免疫组化检测大脑皮层FoxO3蛋白胞浆、胞核转位情况中，正常组细胞核阳性细胞比例为6%，暴露结束后为17%，结束后 8 h为52%，表明暴露结束后8 h入核现象更加明显。结论 FoxO3可以明显减轻高压氧引起的急性中毒，以防止氧化应激过程中脑组织的伤害。

[关键词] 高压氧;急性氧中毒;FoxO3蛋白含量;FoxO3 mRNA含量

[中图分类号] R363          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）07-0031-02

FoxO3 protein expression in brain tissue after hyperbaric oxygen exposure

YU Xue

International Education College， Nanyang Medical College， Nanyang 473000， China

[Abstract] Objective To investigate the central nervous system reaction and pathological changes of mice exposed to hyperbaric oxygen， the role and mechanism of FoxO3 protein， and the effect of FoxO3 on acute oxygen toxicity. Methods Twenty-four mice with body weight from 24 to 28 g were randomly divided into the FoxO3 protein content determination group and the FoxO3 mRNA content determination group， with 12 mice in each group. Twelve mice in the FoxO3 protein content determination group were randomly divided into 4 groups： in the cerebral cortex of mice exposed to 6 absolute atmospheres （ATA） for 30 minutes were collected at 0h， 8 h and 24 h， respectively. The FoxO3 mRNA content determination group was also divided into groups in this way. The expression of FoxO3 protein in cerebral cortex and the location of FoxO3 were detected to explore the signal， conduction pathway and mechanism of FoxO3 action. Results In the cerebral cortex， with FoxO3 protein expression detected by the Western blot， the gray value ratios of protein were 1.000 in the normal group， 1.128 at 0 h after exposure， 1.736 at 8 h after exposure， and 1.504 at 24 h after exposure， indicating that the content reached the peak at 8 h after exposure. Immunohistochemistry was used to detect the cytoplasmic and nuclear translocation of FoxO3 protein in the cerebral cortex. The proportions of nuclear positive cells were 6% in the normal group， 17% at 0 h after exposure， and 52% at 8 h after exposure， indicating that nucleation was more obvious at 8 h after exposure. Conclusion FoxO3 can significantly reduce the acute toxicity caused by hyperbaric oxygen and prevent the damage of brain tissue during oxidative stress.

[Key words] Hyperbaric oxygen; Acute oxygen toxicity; FoxO3 protein content; FoxO3 mRNA content

大于一个大气压的压力为高压，高压氧（hyper-baric oxygen， HBO）治疗是将身体置于高压环境和呼吸纯氧来治疗疾病。高压氧（HBO）现在已广泛应用于许多方面，如潜水作业和临床工作。最近有关船员潜水的调查表明，快速上升之前呼吸高压氧（HBO），可以明显缓解减压病的发生。临床上HBO可改善组织缺氧，促进组织的氧合作用，促进伤口愈合，并在其他生化和细胞过程发挥有益作用。高压氧作为辅助疗法治疗骨坏死[1]和皮肤皮瓣移植。但是如果吸入过高的氧分压，有毒反应会很快发生。急性氧中毒的主要临床表现是中枢神经系统（central nervous system， CNS）的功能障碍，因此，研究其发病机制，对预防和治疗氧中毒非常有意义[2]。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理

24只雄性小鼠，体重24～28 g，随机分为FoxO3蛋白含量测定组和FoxO3 mRNA含量测定组，每组12只。将FoxO3蛋白含量测定组的12只小鼠再随机分为四组，每组3只小鼠。正常组：不进行暴露处理;在 6个绝对大气压高压氧条件下暴露 30 min，暴露结束后0 h（HBO暴露组1）、暴露结束后8 h（HBO暴露组2）、暴露结束后24 h（HBO暴露组3）分别取大脑皮层;FoxO3 mRNA含量测定组同样分组。

1.2 组织中FoxO3蛋白含量的测定

用戊巴比妥麻醉小鼠并处死，取大脑皮层。用裂解缓冲液裂解组织并离心。通过蛋白质印迹法取上清液以检测FoxO3蛋白含量，使用Image J 2X 软件分析灰度值[3]，每组3只小鼠。

1.3 组织中FoxO3 mRNA含量测定

小鼠暴露结束后，取大脑皮层。采用戊巴比妥麻醉小鼠并处死，用RT-PCR法检测脑组织中FoxO3 mRNA含量。

1.4 统计学方法

用 SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验;多组之间先进行方差齐性检验，后使用F检验和LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot 检测 FoxO3 蛋白表达

在大脑皮层中，正常组蛋白灰度值比为 1.000，暴露结束后 0 h 为 1.128，结束后8 h 为1.736，结束后24 h为1.504。结果表明，高壓氧暴露结束后8 h， FoxO3 α蛋白含量达到峰值。见表1，封三图3。

2.2 RT-PCR 检测 FoxO3 mRNA 表达

在大脑皮层中，正常组 mRNA 扩增倍数为1.00，暴露结束后 8 h为0.85。表明高压氧暴露结束后8 h，FoxO3的 mRNA 表达量变化不明显。见表2。

2.3 免疫组化法测 FoxO3 胞浆、胞核转位情况

在大脑皮层，正常组胞核阳性比例是6%，暴露结束后0 h 为17%，结束后8 h为 52%。结果表明高压氧暴露结束后 8 h，FoxO3入核现象明显。见表3、封三图4。

3 讨论

高压氧（HBO）在临床和潜水中应用范围较广，但是当机体长时间吸入高压氧时，可导致氧中毒。目前，研究人员对中枢神经系统氧中毒（OT）的发病机制及其预防措施的了解还有限。人们普遍认为，HBO暴露可导致组织中氧含量的增加，远远超过线粒体通过细胞呼吸将其完全还原为H2O分子的能力。由于存在过量的氧气，呼吸被过度激活，会产生大量的ROS，引发一系列强烈的氧化应激反应，导致OT症状。研究表明，FoxO3能结合启动子，如FasL基因[4]，P21基因[5-6]，激活 Catalse 基因[7]。

FoxO3既可以诱导又可以保护细胞凋亡，扮演各种不同细胞和不同组织氧化应激的作用机制[8-10]。当氧分压足够高（6 ATA）时，FoxO3的核进入和蛋白表达过程可以在30 min暴露下启动，表明FoxO3对HBO暴露这种氧化刺激有很高的敏感性，并且确实会积极参与抵消HBO对人体的氧化损伤[11]，进一步证明它与OT有密切的关系。

经高压氧暴露后，FoxO3 含量升高[12]。HBO暴露结束后8 h，FoxO3蛋白达到峰值，蛋白明显进入核内，表明FoxO3可明显减轻高压氧引起的急性中毒;以防止氧化应激过程中脑组织的伤害[13]，这与Wang等[14]及张亚楠[3]报道的相同。

综上所述，深入分析FoxO3在氧化应激途径中各个环节的作用，对于揭示疾病的发病机制和寻找有效对策尤为重要。研究证明FoxO3对HBO暴露的氧化刺激具有高响应性，这也将帮助医务人员更全面地了解HBO对人体的各种作用，包括其治疗作用[15]，均有重要的意义。

[参考文献]

[1]   韦明照，李宏宇.高压氧治疗临床骨科疾病的应用进展[J].现代医药卫生，2020，36（19）：3111-3114.

[2]   刘亚玲，于秋红，王丛，等.高压氧与中枢型氧中毒的研究进展[J].中华物理医学与康复杂志，2019，（8）：631-633.

[3]   张亚楠.转录调节因子FoxO3在高压氧致急、慢性氧中毒中的作用研究[D].西安：第二军医大学，2016.

[4]   张亚楠，陈保民，高阳，等.FoxO3α转录因子与机体氧化应激损伤的研究进展[J].医学研究生学报，2016，29（3）：327-331.

[5]   Wang M，Jiang R，Liu JZ，et al. 20（s）ginseonside Rg3 mod-ulation of AMPK/FoxO3 signaling to attenuate mitoch-ondrial dysfunction in a dexamethasone injured C2C12 myotube based model of skeletal atrophy in vitro[J]. Molec-ular Medicine Reports，2021，23（5）：191-194.