时间:2024-05-13
吴子湘 张炜鹏 童熠瑜 湛晶蕾 梅梓楠 卢丽洁 孙钰卓 张孔胜 王浩冰 谭健
[關键词] 口腔溃疡;大鼠;漱口水;云南白药;炎症因子
[中图分类号] R248 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2021)23-0030-05
Effect and mechanism of self-made mouthwash on traumatic oral ulcer
WU Zixiang ZHANG Weipeng TONG Yiyu ZHAN Jinglei MEI Zi′nan LU Lijie SUN Yuzhuo ZHANG Kongsheng WANG Haobing TAN Jian
School of Stomatology, Changsha Medical College, Changsha 410219, China
[Abstract] Objective To observe the effect and mechanism of homemade mouthwash on traumatic oral ulcer SD rat model. Methods Chemical burning method was used to establish oral ulcer model. Electronic vernier caliper was used to measure the maximum transverse diameter and maximum longitudinal diameter of the wound. The area was recorded and calculated. The weight of each group of rats before modeling and during treatment was recorded and compared. The levels of TNF-α and IL-6 in each group were detected using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The evaluation standard was graded according to the wound condition. The rats were sacrificed after the experiment. The pathological tissues were cut out. And the histopathological changes were observed by HE staining. Results Seven days after treatment, the oral ulcer area in the group D was (0.93±0.27) mm2,which was significantly smaller than that of (1.39±0.22) mm2 in the group C and (4.60±1.19) mm2 in the group B, and the difference was statistically significant (P<0.05). At seven days after treatment, the weight of rats in the group D was(215.50±2.94) g, which was the closest to group A (229.75±6.15) g, followed by the group C (207.81±2.20) g, and finally the group B (191.25±4.30) g. The body weights of rats in group B, C and D were significantly different from those in group A (P<0.05). Seven days after treatment, the difference in the expression levels of serum inflammatory factors TNF-α and IL-6 in each group was statistically significant (P<0.05). Among them, the TNF-α (285.38±3.48) ng/L and IL -6 level of the group D was (69.81±3.20)pg/mL,which was significantly lower than that of (346.69±26.40)ng/L, (93.31±3.40)pg/mL in group B and (305.13±5.48)ng/L, (80.50±2.60) pg/mL in the group C, and the difference was statistically significant (P<0.05). Seven days after treatment, HE staining of the wound showed that the number of inflammatory cells in the group D was less than that in the group C, and significantly less than that in the group B. Fibroblasts in the group D proliferated significantly and new capillaries increased significantly. Conclusion Self-made mouthwash has a good effect on promoting healing and anti-inflammatory in SD rats with traumatic oral ulcer.
[Key words] Oral ulcer;Rats; Mouthwash; Yunnan Baiyao; Inflammatory factors
口腔溃疡(Oral ulcer)可以归属为口腔黏膜较常见、多发类疾病之一[1]。目前由于创伤型口腔溃疡病因尚未明确,大多学者认为口腔溃疡发病原因可能与患者自身免疫功能出现紊乱、所处发育阶段、妇女妊娠期、某些药物的过多使用、感染、精神状态、内分泌失调、身体其他系统疾病等有关,现阶段学者比较一致的认为,免疫学因素在其致病机制中所占比例较大并起着重要作用[2-3]。本实验所自制精油漱口水主要是以茶树精油(Tea tree essential oil,TTO)、葡萄柚精油(Grapefruit essential oil,GEO)和木糖醇为主要成分,外加酒精、蒸馏水稀释。漱口水pH值控制在合理区间,不会引起大鼠口腔酸化而導致脱钙,不影响正常进食;本实验利用两种精油和木糖醇各自作用机制、抗炎、抗菌及促愈合等性质,探讨自制漱口水对模型大鼠口腔溃疡作用及机制,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠64只,体重(200±210)g,雌雄各半,实验SD大鼠购自长沙市天勤生物有限公司,动物许可证号为SCXK(湘)2019-0014。动物饲养和处理均按照长沙医学院动物实验房规定操作进行。本研究获得学校伦理委员会批准通过。所购大鼠牙体、牙列完整、咬合关系正常。
1.2 实验试剂及药物
NaOH晶体(购自双辽蒙东化工有限公司);水合氯醛原料(质量分数99.7%,购自陕西正一药用辅料有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附试验试剂盒(购自武汉纯度生物公司);云南白药粉(云南白药集团股份公司,国药准字Z53020798,规格:4 g/瓶);茶树精油(TTO,纯度98%,江西康盛堂药业有限公司);葡萄柚精油(GEO,纯度98%,广东栋方生物科技股份有限公司);木糖醇(山东龙力生物科技有限公司);75%医用酒精(皖卫消证字[2020]第K0062号);蒸馏水(由长沙医学院基础医学院化学实验室提供)。
1.3实验方法
1.3.1 漱口水的制备 在适应性饲养的同时制备漱口水:酒精20 mL、蒸馏水100 mL、TTO 1 mL、GEO 0.6 mL,木糖醇10 g。将酒精倒入玻璃瓶中,加入TTO和GEO,充分摇晃,再将蒸馏水和木糖醇倒入玻璃瓶中即可,漱口水有效成分含量为11.6 mL,浓度约为8.8%(课题组预实验结果)。
1.3.2 动物模型的建立 为使所形成的溃疡创面大小一致,由同一人操作。采用4%水合氯醛麻醉后,用镊子取NaOH晶体在大鼠左侧颊部靠口角黏膜处烧灼60 s,随后用生理盐水冲洗,30 min后观察上唇内侧口腔黏膜灼烧面。形成直径约5 mm、深度约2 mm的圆形或椭圆形创面[4]。
1.3.3 分组及实验给药 将64只大鼠随机分成四组,每组各16只,分别为空白对照组(A组):不做处理,正常饲养;模型对照组(B组):采用4%水合氯醛麻醉后,仅用生理盐水每天涂敷两次,早晚各1次,连续给药7 d;云南白药组(C组):采用4%水合氯醛麻醉后,先使用生理盐水冲洗创面,再用消毒棉签蘸取云南白药粉均匀涂敷在口腔溃疡处,分别于每日清晨、夜晚各给药1次,给药后30 min不予进食,连续给药7 d;茶树精油组(D组):采用4%水合氯醛麻醉后,先使用生理盐水冲洗创面,再用消毒棉签蘸取自制漱口水涂敷在口腔溃疡处3 min,分别于每日清晨、夜晚各给药一次,给药后30 min不予进食,连续给药7 d 。
1.4观察指标及评价标准
①分别在治疗后1 d、3 d、5 d、7 d给药前的早晨用电子游标卡尺测量大鼠创面最大横径与最大纵径,观察愈合情况,并计算面积。记录造模前大鼠体重和造模后每天给药前大鼠的体重,并比较在治疗过程中各组大鼠每天的体重。②治疗后7 d,各组大鼠尾静脉取血3 mL,装入5 mL采血管内,室温静置60 min,随后采用3000 r/min离心机,离心20 min后收集上层血清,采用ELISA法测定血清炎症指标TNF-α、IL-6水平(具体操作按试剂说明书)。③治疗后7 d,对各组大鼠口腔黏膜情况进行评价标准分级[4],0级:创面完全愈合;Ⅰ级:创面未完全愈合,但无明显假膜;Ⅱ级:创面表面可见黄白色薄的假膜覆盖;Ⅲ级:创面表面假膜较厚,周围可见充血、水肿;Ⅳ级:创面表面假膜厚,周围充血、水肿严重。正常为0分,Ⅰ级为1~3分,Ⅱ级为4~6分,Ⅲ级为7~9分,Ⅳ级为10~12分。④各组大鼠尾静脉取血完成后,对大鼠实行安乐死,随后打开大鼠口腔,切取左侧颊黏膜病理组织约2 mm深度,随即置于4%的福尔马林组织固定溶液中固定1周,再按常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosinstaining,HE),置于光学显微镜下观察。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间两两比较采用独立性t检验,分级采用非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组SD大鼠口腔溃疡面积变化情况比较
治疗后1 d,各组大鼠溃疡面积比较,差异均无统计学意义(P>0.05),治疗后3 d、5 d及7 d各组大鼠溃疡面积逐步缩小,C组与B组比较,差异有统计学意义(P<0.05);D组与B组比较,差异有统计学意义(P<0.05);D组与C组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.2 各组SD大鼠不同时间体重变化情况比较
造模后各组大鼠体重均有明显下降趋势(除A组外),B、C、D组大鼠体重变化与造模前比较,差异有统计学意义(P<0.05),B组第6天大鼠体重开始增加,C组第4天开始增加,D组第3天开始增加,B、C、D组体重开始增加时间比较,差异有统计学意义(P<0.05),治疗第7天后B、C、D组与A组体重比较,差异有统计学意义(P<0.05),与A组接近大小顺序为D组>C组>B组,提示自制漱口水可以缩短愈合和疼痛时间,提前恢复正常生活。见表2。
2.3 各组SD大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6检测水平比较
与A组比较,B组大鼠血清炎症因子TNF-α和IL-6水平上升,差异均有统计学意义(P<0.05),同时C组和D组TNF-α和IL-6水平明显低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05),D组TNF-α和IL-6水平低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。自制漱口水治疗大鼠口腔溃疡模型机制或许与炎症细胞因子导致的免疫功能调节有关。见表3。
2.4 各组大鼠病理组织变化情况
HE染色后,光镜下(×40)观察各组病理切片(封三图1),可见A组组织之间结构紧密,未见炎症细胞;B组观察到淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞积聚浸润明显,血管充血、水肿严重、纤维结缔组织疏松和少见新生毛细血管;C组可观察到少量炎症细胞浸润,可见明显的新生毛细血管和近似成纤维细胞,组织血管充血、水肿情况得到改善,但仍然存在;D组可见较大量明显的新生毛细血管和成纤维细胞,炎症细胞较少见,存在轻微血管充血、水肿情况,但情况明显好于B组,较好于C组。
2.5 模型建立初和治疗后7 d各组大鼠口腔黏膜变化情况比较
模型建立初和治疗后7 d,观察各组大鼠口腔黏膜变化情况(封三图2)。大鼠口腔溃疡建模30 min后,可观察到颊侧创口黏膜组织充血、水肿严重;B组给予生理盐水治疗后7 d,观察大鼠自我愈合能力,还能观察到创口面积大,黏膜组织充血、水肿较严重,可见明显较厚假膜;C组给予云南白药治疗后7 d,口腔溃疡面积缩小显著,黏膜组织充血、水肿情况得到很大改善,但还可观察到组织有充血、水肿情况;D组给予自制漱口水治疗后7 d,口腔溃疡面积显著缩小,黏膜组织充血、水肿很大程度上改善,无出血、水肿或轻微出血、水肿情况,溃疡虽未完全达到建模前水平但无明显假膜,接近愈合,且恢复情况均显著好于B组和C组。
3 讨论
口腔溃疡是发生于患者口腔黏膜上的一类临床多见疾病[5],患病率相对较高。该病的发生具有反复性及溃疡创面具有自我转愈等多种临床表征,当下虽然有许多治疗方法,但缺乏有效的方法,且对口腔溃疡的诊断大多基于病案及临床症状[6-7]。在口腔溃疡病因机制未知的情况下,目前常用于治疗口腔溃疡的药物包括消炎止痛类药物、促进愈合类药物、糖皮质激素类药物、免疫调节类药物等,但都不能从根源上治愈[8]。
通过相关治疗口腔溃疡药物的机制研究发现,该病的发生与免疫功能调节有关,机体中的淋巴细胞和单核细胞释放的某些炎症因子均可诱导口腔溃疡的形成,其中TNF-α和IL-6为其重要炎症因子,起到关键作用[9-12]。炎症因子TNF-α和IL-6参与机体免疫功能的调节,如果机体有炎症形成而引起溃疡时TNF-α和IL-6水平将大幅上升,自制漱口水治疗大鼠口腔溃疡模型的作用及机制可能与炎症因子引起的免疫功能调节有关,通过抑制炎症因子TNF-α和IL-6分泌,进而促使疾病转愈[13-15]。
TTO是从桃金娘科互叶白千层的新鲜枝叶中提取出来的一种天然的香料油,该精油除了能发挥很好的杀菌抑菌功能,添加在日常护肤品中还能起到保健作用,且本身无毒害。据学者研究,TTO中含有一种松油烯-4-醇的成分,松油烯-4-醇在抗炎作用中起到关键作用。有研究发现,TTO不仅具有抗炎作用,还具有促进愈合、抗肿瘤作用,而且其安全性可靠[16]。之前有研究显示,TTO对某些有害机体的细菌有较强抑制性和杀伤性,TTO可以杀死耐甲氧西林金葡菌和金黄色葡萄球菌,其与熏衣草精油混合还是自制伤口软膏中的完美成分,可以促进伤口愈合;漱口水另一种成分GEO,其是一种安全、天然的抑菌剂和抗氧化剂,其作为一种重要的食品添加剂用于食品中,且可以调节血压、增强食欲等[17]。近些年,有研究显示,GEO对较多微生物的杀灭性、抑菌能力、修復作用及在受药耐药方面、残留方面均比大多化学类人工合成药品有明显的优势,具有广泛的开发利用及推广前景[18];第三种成分是木糖醇,常用于无糖口香糖中,其具有防龋、消炎抗菌等功能,并拥有良好的甜味,加在漱口水中可以起到加香作用,还会增强漱口水清凉感[19]。云南白药可抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达,对控制炎症的发展起到一定的作用,且具有活血化瘀、消肿止痛之功效,其有明显的止血作用,可加速血管的生长及结缔组织增生,加速创面肉芽组织增生和上皮细胞增殖,防止继发感染,促进伤口愈合,减轻疼痛,缩短疗程,且在临床上治疗口腔溃疡、皮肤创伤、出血等有良好功效[20]。因此,本研究选择自制漱口水为实验组用药,云南白药为阳性对照组用药,生理盐水为阴性对照组用药。
本研究结果显示,自制漱口水与云南白药作用比较,自制漱口水疗效显著,且可加速促进大鼠口腔黏膜修复,明显缩短溃疡愈合时间,显著抑制炎症因子TNF-α和IL-6生成和释放,可能与漱口水中含有多种抗炎、促愈合类药物成分之间的协同作用有关。本研究首次将TTO、GEO及木糖醇应用于治疗口腔溃疡的动物实验中,也是首次将木糖醇配合两种精油制作成漱口水。依据以往研究结果显示,TTO和GEO作为天然药物具有取材广、安全、毒副作用小等优点,用于口腔疾病的预防与治疗中有着巨大的优势和潜力,且前景广泛,加上木糖醇具有可食用性,故预实验及正式实验中大鼠未出现明显不良反应或毒性作用,但还需要大量的动物和临床实验证实,临床实验中应更加关注患者的个体差异性和药物的安全性及有效性。因此,本实验为今后口腔溃疡的临床治疗及该自制漱口水的推广应用提供一定实验室依据和可支撑数据,希望在临床应用中对自制漱口水预防和治疗口腔溃疡的最佳作用时间、用法及安全等情况开展进一步的研究。
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(收稿日期:2021-02-02)
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