山豆根内生真菌的分离与鉴定

纳秋霞 舒燕 张毅 蔡乐 赵景云 宋娜丽

[摘要] 目的 从山豆根中分离鉴定内生真菌。 方法 利用PDA培养基对山豆根进行内生真菌的分离，采用分子生物学手段进行鉴定，通过16S rRNA 基因序列分析，比对结果。 结果 从山豆根中分离得到35株内生真菌，共9属13种，镰刀菌属、间座壳属、刺盘孢属和青霉属均为优势菌属。 结论 山豆根中含有丰富的内生真菌资源，进一步开发利用山豆根中内生真菌资源具有重要意义。

[关键词] 山豆根;内生真菌;镰刀菌属;亚隔孢壳属

[中图分类号] Q939.9;S567.19          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）21-0047-04

Isolation and identification of endophytic fungi from radix sophorae subprostratae

NA Qiuxia1 SHU Yan2 ZHANG Yi3 CAI Le2 ZHAO Jingyun1 SONG Nali1， 2

1.Central Laboratory， Yunnan Institute of Chinese Medicine， Kunming 650223， China; 2.School of Chemical Science and Technology， Yunnan University， Kunming 650091， China;  3.Kunming Baker Norton Pharmace-utical Co.， Ltd.， Kunming 650100， China

[Abstract] Objective To isolate and identify endophytic fungi from radix sophorae subprostratae. Methods The endophytic fungi were isolated from the radix sophorae subprostratae by using PDA medium， and identified by molecular biological methods. The results were compared by 16S rRNA gene sequence analysis. Results 35 strains of endophytic fungi were isolated from the radix sophorae subprostratae， with a total of 9 genera and 13 species. Fusarium， Diaporthe， Colletotrichum and Penicillium were all dominant genera. Conclusion Radix sophorae subprostratae is rich in endophytic fungi resources， and it is of great significance to further develop and utilize the endophytic fungi resources in radix sophorae subprostratae.

[Key words] Radix sophorae subprostratae; Endophytic fungi; Fusarium; Didymella

山豆根為双子叶植物纲豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep）的干燥根和根茎，是临床常用的中药之一[1]，其性味苦，寒，有毒，归肺、胃经，具有清热解毒、消肿利咽的作用。临床上常用于火毒蕴结、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛、口舌生疮等。山豆根生长环境特殊，喜高温，大多生长于石山脚下、岩缝或灌丛林缘，主要分布于中国西南地区的云南、广西、贵州、广东、江西等温度较高的省份，此外，越南也是山豆根的重要产区[2]。山豆根野生资源分布较为广泛，但2003年以后，国内以山豆根为原料提取苦参碱、氧化苦参碱等用于生产抗肿瘤、抗癌新药，致使市场上山豆根的需求量迅速递增，野生资源濒危。山豆根化学成分丰富，药理活性广泛，具有较好的利用价值[3]。但目前的药理作用研究主要集中在生物碱和多糖，有关黄酮、三萜类及其他成分的药理作用报道较少，因此，山豆根值得深入研究，加强综合利用和开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山豆根新鲜药材于2018年7月采集于云南省文山州西畴县，由云南省中医中药研究院主任药师赵景云鉴定为山豆根，标本保存于云南省中医中药研究院。实验用试剂NaClO溶液、乙醇购于昆明利健，青霉素、卡那霉素、无水硫酸镁、葡萄糖购于西陇化工。

1.2 内生真菌的分离与培养

1.2.1 分离培养基  马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：200 g新鲜马铃薯切块用适量水煮沸30 min后，纱布过滤，滤液加20 g葡萄糖、15 g琼脂（150 mg卡那霉素和150 mg青霉素）至充分溶解后，定容至1000 mL，分装后，高压灭菌锅于121℃下灭菌30 min[4]。

孟加拉红培养基：孟加拉红0.333 g、氯霉素0.1 g、KH2PO4 1.0 g、琼脂20.0 g、蛋白胨5.0 g、无水硫酸镁0.5 g、葡萄糖10.0 g（150 mg卡那霉素和150 mg青霉素），搅拌加热煮沸至完全溶解，定容至1000 mL，分装后用高压灭菌锅于121℃下灭菌30 min[5]。

1.2.2 山豆根药材的前处理  山豆根用自来水冲洗至水澄清，晾干后放置于超净工作台，进行表面消毒：先将山豆根在5%的次氯酸钠溶液中浸泡1 min，然后用灭菌过的超纯水（UP水）冲洗3遍，再置于75%的乙醇溶液中浸泡1 min，取出后同样用灭菌过的UP水冲洗3遍，最后用滤纸将山豆根表面的水分吸干[6]。

1.2.3 分离与培养  剪刀、镊子高压灭菌，将山豆根块根用剪刀去皮，剪碎成小块，用镊子将剪碎山豆根块根平铺在配置好的孟加拉红培养基和PDA培养基表面，每个培养基上均匀放置3块，并初步固定，封口膜封好培养皿，放置于（28±1）℃恒温培养箱中培养孵化[7]。每隔24 h观察1次，待菌落形成，在培养皿上做好标记，将菌挑于单个PDA平板培养皿内，重复此步骤至不能再挑出形态不一样的菌落为止。根据菌落形态特征，采用平板梯度稀释法分离、纯化内生菌，最后，将已纯化的单一的菌株转入PDA斜面培养基，于（28±1）℃恒温培养7 d[8]。

1.3 DNA的提取

将菌株接于PDA培养基中于25℃摇床恒温培养72 h，收集新鲜的菌丝，用CTAB法对总DNA进行提取[9]。方法如下：在1.5 mL的离心管中加入适量灭菌石英砂，挑取适量的菌丝，加入65℃预热过的2XCTAB提取液250 μL进行研磨，完毕后再加入2XCTAB提取液使最终体积为500～600 μL，在65℃下水浴30 min，间隔7～8 min翻转混匀1次，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）混合液，进行震荡，震荡3～5 min后12000 rpm离心10 min[10]，将上清液取于另一无菌离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混合液，进行震荡，震荡3～5 min后，12000 rpm离心10 min，再取出上清液，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃沉淀30 min，离心，弃上清液，重复操作，空气干燥直到沉淀透明无色，加入30～50 μL无菌水溶解，-20℃保存备用[11]。

1.4分子生物学信息分析

对提取的DNA产物，进行内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer）扩增，结果与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology）数据库中的BLAST程序进行比对[12]。菌种测序委托北京擎科生物科技有限公司完成。

2 結果

对山豆根根部分离得到35株内生真菌，经形态学和ITS分子测定鉴定为7目9科9属13种，从门和纲的层次看，分离得到的内生菌子囊菌门粪壳菌纲较多（29株10种），占分离的菌株82.86%，属于优势门（94.29%）和优势纲（82.86%），在目科属种上具有丰富多样性。在目的水平上，肉座菌目和格孢腔菌目为优势目，分别为9株和7株，分别为3个种和2个种，为优势目。在科的水平上，丛赤壳科、间座壳科、小丛壳科和曲霉科分别有2个种，分别分到了6、5、4和4株，丛赤壳科为优势科（占17.14%）。在属的水平上，镰刀菌属分到了6株（占17.14%），亚隔孢壳属分到5株，为优势菌属。另外，还分到毛霉门Mortierellomycotina纲菌株2株1种。结果见表1、表2，可看出山豆根内生真菌形态各异，种属丰富。

3讨论

自然界中菌种资源较多，以特殊生存环境内生菌为重点研究的植物较有意义，尤其是在高寒、干旱、低纬度高海拔等极端环境中的植物内生菌往往会产生特殊的生理功能和次级代谢产物，对于中药材以及天然产物的研究具有重大应用价值[13]。因此，从不同生态环境，尤其是特殊生态环境中筛选得到的中药材内生真菌，得到结构高特异性、高活性物质以及有效成分富集的几率也将大大增加[14]。而且从中药材根、茎、叶以及根际土壤等不同部位分离的内生真菌，从种类和数量来讲，从根部分离的内生菌多于从茎、叶部分离的内生菌，土壤中分离的内生菌种类和数量也较多，与药材化学成分、生长环境关系较密切，内生菌种类和数量庞大而复杂，对其他植物化学成分结构和活性影响较大[15-16]。植物内生真菌生活在植物茎、叶柄、根和叶的细胞或细胞间隙中，物种多样性丰富，能产生药用成分和大量具有生物活性的产物[17]。植物与内生真菌互利共生，关系密切，前者保护和喂养后者，后者“回报”生物活性（植物生长调节剂、抗菌、抗真菌、抗病毒、杀虫等）物质，以这样的方式来增强宿主在自然界的竞争力，因此可以也可以作为道地药材研究的重点对象。

在一些植物中，内生菌参与某些重要次生代谢产物的合成，而另一些植物则是在内生菌的刺激下合成特殊的次生代谢产物[18]。甚至内生菌与宿主植物合成相同的次生代谢产物，从而增加植物中这一次生代谢产物的积累[19]。正是这些作用，导致不同内生菌和植物相互作用，引起植物化学成分的富集或减少，甚至产生新的化合物，有助于人们筛选可富集有效成分的内生菌，也便于寻找降低药材毒性的内生真菌，或者是从中发现新的次生代谢产物[20]。本研究后期将对山豆根中内生真菌是否对其生物碱类有效成分苦参碱和氧化苦参碱的含量变化产生影响开展深入研究。本研究发现从山豆根中分离得到了35株内生真菌，共9属13种，其中亚隔孢壳属（Didymella glomerata）和镰刀菌属（Fusarium redolens）的菌株所占比例最大，为优势种属;其次是间座壳属（Diaporthe vaccinii），研究结果在一定程度上说明山豆根内生真菌的生物多样性，为后期内生真菌的发酵改性奠定了较好基础，进一步开发利用山豆根内生真菌资源具有重要意义。

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