不同浓度南葶苈子水提液对心衰大鼠心功能的干预研究

董竹琴　罗颖　杨明　孙志强　林冬铭　窦丽萍　黄抒伟

[摘要] 目的 探讨不同浓度南葶苈子水提液在心力衰竭大鼠心室重构中的作用。 方法 32只SD大鼠随机分为4组，为假手术组（sham group）、模型组（HF group）、南葶苈子-5 g/kg组（HF+DS-A 5 g/kg group）和南葶苈子-10 g/kg组（HF+DS-A 10 g/kg group）。采用肾上腹主动脉缩窄术制作大鼠心力衰竭模型（假手术组除外）。4周后超声心动图及血流动力学检测心功能、HE染色和电镜观察心室重构;TUNEL法测定细胞凋亡。 结果 超声心动图发现：模型组左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）明显增厚，左室射血分数（LVEF）及短轴缩短率（FS）显著下降（P<0.05）;与模型组相比，南葶苈子-5 g/kg 组及南葶苈子-10 g/kg组LVPWd均明显偏低，而LVEF、FS显著增加（P<0.05）;南葶苈子-5 g/kg 组及南葶苈子-10 g/kg组之间无明显差异（P>0.05）。血流动力学监测显示：与假手术组相比，模型组左室舒张末压力（LVEDP）、左室收缩末压力（LVESP）指标明显升高;与模型组比较，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组大鼠的LVEDP和LVESP指标显著降低（P<0.05）;南葶苈子-10 g/kg组LVEDP与LVESP的值相较南葶苈子-5 g/kg组偏低，但结果无统计学意义（P>0.05）。HE染色观察发现假手术组大鼠心肌纤维排列整齐、致密;模型组大鼠心肌组织病理切片见心肌细胞肥大且排列错乱，细胞间隙增大;南葶苈子-5 g/kg组和南葶苈子-10 g/kg组心肌细胞肥大不明显，心肌纤维排列较整齐。电镜结果显示：假手术组心肌纤维组织排列规则，线粒体嵴致密有序。模型组心肌纤维紊乱;线粒体肿胀、空泡化。在南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg組中，心肌细胞轻度肿胀，膜结构较清晰，肌原纤维排列较整齐，线粒体轻度肿胀。TUNEL染色法显示：模型组大鼠心肌细胞凋亡数量显著增加（P<0.05）;与模型组相比，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组大鼠心肌细胞凋亡数量显著降低（P<0.05）;南葶苈子-5 g/kg组与南葶苈子-10 g/kg组比较细胞凋亡数量接近（P>0.05）。 结论 南葶苈子水提液具有改善心力衰竭大鼠心脏功能、抑制心室重构及减少心肌细胞凋亡的作用;不同浓度南葶苈子水提液干预后的效果无明显差异。

[关键词] 南葶苈子;浓度;心力衰竭;心功能;细胞凋亡

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）11-0038-05

Intervention of different concentrations of aqueous extract from Semen Lepidii on heart function in rats with heart failure

DONG Zhuqin1   LUO Ying2   YANG Ming1   SUN Zhiqiang3   LIN Dongming1   DOU Liping1   HUANG Shuwei1

1.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University of Chinese Medicine，  Hangzhou   310005， China; 2.The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou   570102， China; 3.The First People's Hospital of Yuhang District in Hangzhou， Hangzhou   311100， China

[Abstract] Objective To explore the role of different concentrations of aqueous extract from Semen Lepidii in ventricular remodeling in heart failure rats. Methods 32 SD rats were randomly divided into 4 groups： sham group， model group（HF group）， Lepidii-5 g/kg group（HF+DS-A 5 g/kg group） and Lepidii-10 g/kg group（HF+DS-A 10 g/kg group）. Adrenal aortic constriction was used to make rat heart failure model（except sham operation group）. After four weeks， echocardiography and hemodynamics were used to detect cardiac function， HE staining and electron microscopy were used to observe ventricular remodeling; TUNEL method was used to determine apoptosis. Results Echocardiography revealed that the left ventricular posterior wall diastolic thickness（LVPWd） in the model group was significantly thickened， and the left ventricular ejection fraction（LVEF） and fraction shortening（FS） were significantly decreased（P<0.05）. Compared with the model group， the LVPWd of the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group were significantly lower， while the LVEF and FS increased significantly（P<0.05）; there was no significant difference between Lepidii-5 g/kg group and Lepidii-10 g/kg group（P>0.05）. Hemodynamic monitoring showed that compared with the sham group， left ventricular end diastolic pressure（LVEDP） and left ventricular end systolic pressure（LVESP） were significantly increased in the model group; compared with the model group， the LVEDP and LVESP of the rats in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group were significantly reduced（P<0.05）; the values of the LVEDP and LVESP in the Lepidii-10 g/kg group were lower than those in the Lepidii-5 g/kg group， but the differences were not statistically significant（P>0.05）. HE staining revealed that myocardial fibers in the sham group were arranged neatly and densely; the pathological section of myocardial tissue in the model group showed myocardial cells were enlarged and arranged disorderly， and the cell gap increased; the myocardial cell hypertrophy in the Lepidii-5 g/kg group and Lepidii-10 g/kg group was not obvious， and the myocardial fibers were arranged neatly. Electron microscopy results showed that myocardial fibrous tissue was arranged regularly and mitochondrial crests were dense and orderly in the sham group. Myocardial fiber disorder， mitochondria swelling and vacuolation were showed in the model group. In the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group， the myocardial cells were slightly swollen， the membrane structure was clear， the myofibrils were arranged neatly， and the mitochondria were slightly swollen. TUNEL staining showed that the number of cardiomyocyte apoptosis in the model group was significantly increased（P<0.05）; compared with the model group， the number of cardiomyocyte apoptosis was significantly reduced in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group（P<0.05）; the number of apoptosis was similar in the Lepidii-5 g/kg group and the Lepidii-10 g/kg group（P>0.05）. Conclusion Aqueous extract from Semen Lepidii has the effects of improving cardiac function， inhibiting ventricular remodeling， and reducing myocardial cell apoptosis in rats with heart failure. The effects of different concentrations of aqueous extract from semen Lepidii have no significant difference.

[Key words] Aqueous extract from Semen Lepidii; Concentration; Heart failure; Heart function; Apoptosis

心力衰竭是指由于各种心脏的结构和（或）功能性的疾病，引起心室的收缩和（或）舒张能力下降，导致一系列肺循环或体循环淤血症状的一组临床综合征，是各类心脏疾病的终末阶段。目前慢性心力衰竭的发病率和死亡率仍呈继续增长趋势。高血压是最常见的心血管疾病之一，也是心力衰竭的主要原因。长期高血压引起的压力负荷增加会对心脏产生持续性机械刺激，易引起心肌肥厚，常导致心力衰竭恶化[1]，并增加心源性死亡率[2，3]。目前慢性心力衰竭的治疗中，药物治疗是基石。研究证实西药如血管紧张素Ⅱ转换酶抑制剂、β受体阻滞剂和醛固酮受体拮抗剂等能有效改善心肌肥厚，降低心力衰竭的死亡率和再住院率，但部分患者常因药物副作用或血压心率等不能耐受而无法应用上述药物。

南葶苈子为十字花科植物播娘蒿的干燥成熟种子，其水提液[Aqueous Extract from Descurainia sophia（L.）Webb. ex Prantl DS-A]具有止咳平喘、促进排尿、减轻水肿、改善心功能的功效，能使心衰患者获益。既往研究表明[4]，南葶苈子水提液可抑制心室重构，改善心功能，但其具体机制尚不明确。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，与心力衰竭的发生发展明显相关，过度的心肌细胞凋亡可导致心室重构、心肌肥厚和心功能不全[5，6]的进展。

因此，本实验以腹主动脉缩窄所致心力衰竭大鼠为研究对象，明确不同浓度南葶苈子水提液对心室重构的作用，并初步探索其可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物

雄性SD大鼠32只，体重（220±10）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，实验动物生产单位为上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号为：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 实验主要药品与试剂

南葶苈子提取液：南葶苈子购于浙江中医药大学附属第二医院，由浙江中医药大学药物研究所制备。水提液的制备方法：取南葶苈子200 g，8倍量70℃水浴提取3次，每次1 h，合并滤液浓缩至100 mL备用，每1 mL相当于2 g原生药。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（美国罗氏公司）;抗心肌肌钙蛋白抗体（购自上海联迈生物工程有限公司）。

1.3 建模及分组

心衰大鼠造模过程[7]如下：术前12 h禁食，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔麻醉SD大鼠。采用剑突下腹正中偏左0.5 cm切口切开腹腔，钝性游离腹主动脉。选用8号注射器的针尖，平行于腹主动脉放置于4号线上并结扎。轻轻地抽出针尖，使腹主动脉的面积减少至原50%～60%大小，喷青霉素粉，关腹。除假手术组仅分离腹主动脉，不进行腹主动脉缩窄外，其余组均采用上述方法造模。常規喂养4周后，取腹主动脉缩窄术后大鼠随机分为模型组、南葶苈子-5 g/kg组、南葶苈子-10 g/kg组。南葶苈子-5 g/kg组、南葶苈子 -10 g/kg组分别予南葶苈子水提液5、10 g/（kg·d）灌胃，假手术组和模型组接受5 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，持续灌胃4周。

1.4 检测方法

1.4.1 超声心动图测量  大鼠经异氟烷雾化麻醉后仰卧位固定，取左胸骨旁短轴切面，收集超声心动图数据。每只大鼠至少测量3个连续的心脏周期;记录左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室后壁舒张末期厚度（left ventricular posterior wall at diastole，LVPWd）和左室缩短分数（fraction shortening，FS）。测量和分析由同一名经验丰富的研究人员进行，并采用盲法。

1.4.2血流动力学检测 大鼠测重后以20%乌拉坦麻醉（浓度为5 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。从颈正中侧切开，然后逐层暴露右侧颈总动脉，钝性分离后结扎远心端，血管夹夹住近心端。将微导管与压力换能器相连接，经右侧颈总动脉将微导管插入，微导管另一端连接压力换能器输入多媒体生物信号记录系统（ALC10 MPA2000）。当微型导管进入左心室后，稳定5 min后测量心率（heart rate，HR）、左室舒张末压力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左室收缩末压力（left ventricular end-systolic pressure，LVESP）等血流动力学指标。

1.4.3 心肌组织切片HE染色  心室标本横切，固定于10%石蜡甲醛缓冲液中24 h，石蜡包埋。切割成4 μm厚的切片，行HE染色。

1.4.4 透射电子显微镜观察  取边缘梗死区心肌组织新鲜标本，4℃下以2.5%戊二醛固定过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，1%四氧化锇静置2 h，用磷酸盐缓冲盐水冲洗3次。在未涂布的铜网面上使用超微粒（Leica.Solms.Germany）标准程序获得3个超薄切片，并用0.2%柠檬酸铅/1%乙酸铀酰进行染色。用JOEL-1400EX透射电子显微镜（日本东京）记录放大20000×倍数的图像。

1.4.5 TUNEL实验检测心肌细胞凋亡  取上述石蜡切片，根据TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）试剂盒的说明书对切片进行染色，采用抗心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）抗体染色心肌细胞，封片、荧光显微镜拍照，导入Image J软件，统计心肌细胞凋亡率。

1.5 统计学分析

所有数据均采用SPSS17.0统计软件进行数据处理和统计学分析，计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠超声心动图检查

超声心动图结果显示：模型组左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）明显增厚，左室射血分数（LVEF）及短轴缩短率（FS）显著下降（P<0.05）;与模型组相比，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组LVPWd均明显偏低，而LVEF、FS显著增加（P<0.05）;南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组之间无明显差异（P>0.05），见表1。超声心动图图像见封三图2。

2.2 血流动力学评估

血流动力学监测显示：与假手术组相比，模型组左室舒张末压力（LVEDP）、左室收缩末压力（LVESP）指标明显升高;与模型组比较，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组大鼠的LVEDP、LVESP指标显著降低（P<0.05）;南葶苈子-10 g/kg组LVEDP与LVESP相较南葶苈子-5 g/kg组偏低，但结果无统计学意义（P>0.05）。见表2及封三图3。

2.3 心肌组织HE染色病理变化

假手术组SD大鼠心肌组织病理切片HE染色可见心肌纤维排列整齐、致密，染色均匀，心肌细胞无肥大，淋巴细胞浸润少见。模型组SD大鼠HE染色可见心肌细胞肥大，细胞间隙增大，淋巴细胞浸润可见，同时心肌纤维排列紊乱。南葶苈子-5 g/kg组和南葶苈子-10 g/kg组心肌细胞肥大不明显，心肌纤维排列较整齐（封三图4）。

2.4 心室组织电镜结果

假手术组心肌纤维组织排列规则，Z线清晰均匀，线粒体嵴致密有序。模型组心肌纤维紊乱，Z线消失，甚至断裂;线粒体形态不一，膜结构不清，嵴紊乱、融合甚至消失;可观察到线粒体肿胀、空泡化。在南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组中，心肌损伤明显减轻，心肌细胞轻度肿胀，膜结构较清晰，肌原纤维排列较整齐，H带较清晰，仍有少量断裂的肌丝，线粒体轻度肿胀（封三图5）。

2.5 TUNEL染色法测定结果

TUNEL测定显示左室心肌组织中TUNEL和cTnI双重染色的代表性照片（标尺：20 μm）。红色表示cTnI信号;绿色表示TUNEL阳性细胞核。假手术组心肌细胞凋亡数少;模型组心肌细胞凋亡数明显上升（P<0.05）;与模型组相比，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组TUNEL染色心肌细胞凋亡阳性细胞数明显减少，但仍多于假手术组（P<0.05）。南葶苈子-5 g/kg组与南葶苈子-10 g/kg组心肌细胞凋亡情况相差不大（P>0.05），证明不同浓度南葶苈子水提液均能抑制心衰大鼠中线粒体介导的细胞凋亡（表3及封三圖6）。

3 讨论

南葶苈子是十字花科植物的一员，广泛分布于亚洲、欧洲、北非和北美。其种子在祖国医学中常用于止咳平喘、利尿消肿、增强心功能。目前已有研究表明，南葶苈子可通过多种机制保护心脏功能。南葶苈子可通过上调血浆多巴胺[8]水平，加强利尿，改善肾功能[9]，减轻心脏负荷。南葶苈子通过增加肺源性心脏病所致心衰大鼠的水通道蛋白AQP1的表达，改善甲状腺激素分泌，消除肺水肿[10]。血管紧张素Ⅱ可以增强醛固酮的释放，导致水和盐分的潴留，致使体液量增多，心脏前负荷增加，加重心力衰竭。而牛磺酸作为南葶苈子的组成成分之一，具有多种药理和生理功能。它可以抗氧化应激和调节钙稳态，对抗儿茶酚胺和血管紧张素Ⅱ[11]，改善心脏代谢[12]。在肾损伤[13，14]的病理机制中，对甲酚硫酸盐（pCS）和吲哚氧基硫酸盐（IS）可明显诱导细胞的炎症反应，影响心脏结构功能。前者通过NAPKH氧化[15]促进心肌细胞凋亡，后者通过AMPK/UCP-2通路[16，17]加重心肌肥厚。研究表明，经南葶苈子治疗后，pCS的排泄量增加，说明南葶苈子可通过促进心、肾毒物的排泄，间接恢复肾功能，改善心肌损伤。

本研究以腹主动脉不完全结扎制造压力后负荷性心衰大鼠模型，实验结果显示：与假手术组相比，模型组LVPWd及LVEDP明显升高，表明心肌舒张功能明显降低，心室重构明显;同时，模型组的LVESP升高，FS及LVEF明显降低，证明心肌的收缩功能及射血能力均显著降低。与模型组相比，南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组心衰大鼠的LVPWd、LVEDP及LVESP明显下降，FS、LVEF明显升高，证明南葶苈子水提液可改善心脏收缩与舒张功能，表明其改善心衰大鼠心室结构和心功能的作用。病理检查发现模型组的心肌细胞肥大，心肌纤维排列紊乱甚至断裂，这些现象在南葶苈子-5 g/kg组及南葶苈子-10 g/kg组明显减轻，证明南葶苈子水提液抑制了心衰大鼠心室重构。TUNEL测定表明南葶苈子水提液可能是通过抑制心肌细胞凋亡来改善心功能不全。在本实验中，南葶苈子-5 g/kg组和南葶苈子-10 g/kg组取得相似的实验结果，提示可能浓度跨度欠大，两种浓度均在有效浓度范围内。

自发性高血压大鼠[18]和原发性高血压患者[19]的左心室心肌细胞肥大和凋亡水平明显升高。心肌细胞的能量代谢与线粒体功能密切相关。既往实验表明，芪苈强心胶囊通过激活AMPK/PGC-1α信号通路来调节脂肪酸和葡萄糖代谢，降低血清游离脂肪酸及乳酸水平，从而保护心肌细胞和线粒体功能[20]。葶苈生脉方通过下调Bax/Bcl-2比值，减少Caspase-3蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡[21]。本次实验结果显示南葶苈子水提液能减轻心衰大鼠心肌细胞的线粒体损伤，改善心肌细胞凋亡，猜测南葶苈子水提液可能是通过线粒体途径抑制心肌凋亡。

綜上所述，南葶苈子可显著预防心力衰竭大鼠心肌肥厚，改善心室重构，其机制可能与抑制心肌细胞凋亡有关。本文数据为南葶苈子预防高血压性心肌肥厚提供了一种新的思路。同时，我们也在后期进行关于芪苈强心胶囊的临床研究，以黄芪、葶苈子等药物为主要成分，为容量过负荷性心衰患者带来更多的临床获益，也积极累积名医大家对于心衰患者的治疗经验。然而，本研究也有一定的局限性：①本研究提出南葶苈子可以改善心功能，但这味中药有很多复杂的成分，不能确切指出发挥疗效的药物成分。②虽然发现南葶苈子能调控心肌细胞凋亡，但其确切的分子机制还需要进一步研究。

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（收稿日期：2019-12-26）