多重耐药鲍曼不动杆菌主动外排系统基因adeFGH的mRNA表达研究

张凯华　　左玲玲　　徐新　　王永东

[摘要] 目的 了解adeFGH系统在鲍曼不动杆菌的多重耐药中发挥的作用。 方法 收集20株鲍曼不动杆菌耐药株（含10株多重耐药株），采用实时荧光定量PCR检测adeFGH外排系统编码基因adeF、adeG和adeH的mRNA表达水平，结合其耐药谱，分析adeF、adeG和adeH的mRNA表达与鲍曼不动杆菌耐药之间的关系。 结果 A、B和C组鲍曼不动杆菌的adeF基因和adeG基因的mRNA的表达水平在各组之间无明显差异（P>0.05）；adeH基因的mRNA表达水平在A组和B组之间无明显差异，A组和B组的adeH基因的mRNA表达水平明显高于C组（P<0.05）。 结论 adeF、adeG、adeH基因共表达时，鲍曼不动杆菌adeFGH外排系统才能形成有效的抗生素外排通道；AdeFGH外排系统针对的外排底物有其局限性，主要针对氟喹诺酮类、β-内酰胺类以及β-内酰胺酶抑制剂等药物。

[关键词] 鲍曼不动杆菌；主动外排泵；多重耐药；adeFGH；mRNA表达

[中图分类号] R378 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）32-0005-03

Study on the mRNA expression of active efflux system gene adeFGH of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii

ZHANG Kaihua1 ZUO Lingling1 XU Xin1 WANG Yongdong2

1.Department of Blood Transfusion， the Second Affiliated Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China； 2.University of South China， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To understand the role of the adeFGH system in multi-drug resistance of Acinetobacter baumannii. Methods A total of 20 Acinetobacter baumannii resistant strains（including 10 multi-drug resistant strains） were collected. Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression levels of the encoding genes of adeF， adeG and adeH in adeFGH efflux system. The relationship between mRNA expression of adeF， adeG and adeH and Acinetobacter baumannii resistance was analyzed in combination with its drug resistance spectrum. Results The mRNA expression levels of adeF gene and adeG gene of Acinetobacter baumannii in group A， B and C were not significantly different among groups（P>0.05）； the mRNA expression level of adeH gene was not significantly different between group A and group B. The mRNA expression levels of adeH gene in group A and group B were significantly higher than those in group C（P<0.05）. Conclusion When the adeF， adeG and adeH genes are co-expressed， the adeFGH efflux system of Acinetobacter baumannii can form an effective antibiotic efflux channel； the adeFGH efflux system has its limitations for efflux substrates， mainly for fluoroquinolones， β-lactams， and β-lactamase inhibitors.

[Key words] Acinetobacter baumannii； Active efflux pump； Multi-drug resistance； adeFGH； mRNA expression

抗生素的出現极大地推动了现代医学的发展[1]。但是，随着抗生素的广泛和长期的使用，产生了耐药菌，且随着抗生素的持续滥用，出现了多重耐药菌，这进一步加大了治疗的难度[2，3]。统计表明，目前，全世界每年因抗生素耐药而导致死亡的人数已达70万，预计到2050年将达到100万[4]。

鲍曼不动杆菌是一种非发酵革兰阴性条件致病菌，能引起多种院内感染，可能引起严重的后果，且鲍曼不动杆菌极易产生耐药。在世界卫生组织公布的对人类危害最大的耐药菌中，耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌位列第1位[5]。目前，鲍曼不动杆菌的耐药率达89.6%，而对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达62.8%和59.4%[6]。

多重耐药鲍曼不动杆菌主要由外排泵介导。目前在鲍曼不动杆菌中发现了与耐药有关的5类外排泵[7-10]，其中，RND家族是最普遍存在的，具有广谱底物外排功能，与多重耐药的关系最为密切。RND家族中，adeABC和adeFGH主要与外源获得性耐药有关，而adeIJK主要与内源性耐药有关[11-13]。

由于adeFGH是最近发现的鲍曼不动杆菌RND外排泵，对其作用机制尚不十分明确，本研究收集了20株鲍曼不动杆菌耐药株，其中多重耐药株为10株，采用荧光定量RT-PCR法检测鲍曼不动杆菌的外排系统编码基因adeF、adeG和adeH的mRNA表达水平，以了解外排泵adeFGH是否在鲍曼不动杆菌的多重耐药中发挥作用，为深入研究鲍曼不动杆菌的耐药机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

从南华大学附属第一医院住院及门诊患者送检的各类临床标本中收集鲍曼不动杆菌20株（含多重耐药株10株）。标本来源主要为痰、伤口分泌物、血液、引流物、尿液和大便。编号及抗菌谱情况如下：4（B）、10（A）、15（A）、19（B）、20（A）、25（C）、27（C）、28（C）、29（C）、30（B）、32（C）、38（B）、39（C）、40（C）、42（C）、48（C）、49（C）、51（B）、55（B）、59（A），其中，A=全耐药；B=氨基糖苷类和复方新诺明敏感，其他抗生素耐药；C=阿莫西林和一、二代头孢菌素类抗菌药物耐药，其他抗生素敏感。质控标准菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2培养基

采用血琼脂平板对鲍曼不动杆菌进行培养。

1.3 主要试剂

超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture（with Rox）、DNase等主要试剂均购自CWbio.Co.Ltd。

1.4 引物

根据GenBank上公布的基因序列，应用Lasergene 8.1.3软件设计，由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.5 细菌总RNA的提取及cDNA的合成

用超纯RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，用第一链合成试剂盒反转录生成cDNA，并于-80℃条件下保存备用。上述实验操作均按产品说明书进行。

1.6 adeF、adeG和adeH的表达分析

1.6.1 反应体系及反应条件 采用Real-Time PCR扩增adeF、adeG和adeH基因和内参基因——16S rDNA时，总反应体系为20 μL，含UltraSYBR Mixture（2×）10 μL，上、下游引物（10 μM）各0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。扩增程序为95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 60 s）×40个循环。

1.6.2 标准曲线建立 取一个样本的cDNA以5倍的梯度进行倍比稀释，各取2 μL作模板扩增。在60℃～95℃进行融解曲线分析，并绘制目的基因和内参基因的标准曲线，选择扩增曲线和溶解曲线最好的稀释倍数作为反应的模板浓度。

1.6.3 样本扩增及数据分析 将各样本的cDNA稀释10倍，各取2 μL作模板进行扩增，每个反应均做3个复孔。以4号为对照，按照2-△△ct相对定量计算公式进行结果的计算，其中，ΔΔct=（ct目的基因-ct内参基因）实验组-（ct目的基因-ct内参基因）对照组。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对A、B和C组之间adeF、adeG和adeH的表达量分别进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线及溶解曲线

标准曲线及溶解曲线见封三图1～3。由图可知，ade F、adeG、adeH的标准曲线R2均达到0.99，具有较高的线性相关度，基因扩增效率均大于90%，扩增产物的Tm值均一。这说明引物特异性很强，反应体系和反应条件设置合理。

2.2 ade F、adeG、adeH的Real-Time PCR扩增

各基因的产物溶解曲线见封三图4～6。由图可知，各基因的溶解曲线的波峰锐利，没有出现其他异常波形，说明ade F、adeG、adeH的扩增具有很好的特异性，且峰值所对应的温度和预期产物的Tm值一致。

2.3 各样本相对定量结果

以4号样本为对照，采用2-△△ct相对定量计算公式对Real Time-PCR的原始检测结果进行计算，获得各样本中目的基因的相对定量结果（表2）。

对ade F、adeG、adeH基因的mRNA表达相对定量结果进行的统计分析表明，A、B和C组鲍曼不动杆菌的adeF基因和adeG基因的mRNA表達水平在各组之间无明显差异（P>0.05）；adeH基因的mRNA表达水平在A组和B组之间无明显差异（P>0.05），但A组和B组的adeH基因的mRNA表达水平明显高于C组（P<0.05）。

3 讨论

本文结果表明，A组和B组adeH基因的mRNA表达水平显著高于C组（P<0.05），但C组也有部分菌株的adeH基因mRNA呈现高表达，如40号菌株，其adeH基因的相对表达量达到了1.86，是三组所有菌株中表达量最高的一株，但该菌株仍然是敏感株，所以adeH基因的单独表达与鲍曼不动杆菌的多重耐药性无明显关系。研究发现，C组所有菌株均缺失adeF、adeG、adeH三个基因中的一个或两个，这表明adeFGH外排系统发挥外排作用时，可能需要adeF、adeG、adeH基因共表达，才能形成有效的抗生素外排通道。而C组鲍曼不动杆菌之所以对阿莫西林以及一、二代头孢菌素类抗菌药物产生耐药，应该是其他耐药机制发挥了主要作用。与鲍曼不动杆菌adeABC外排系统的情况完全不同。对鲍曼不动杆菌adeABC外排系统的研究表明，当使adeB失活时，抗生素对菌株的最低抑菌浓度与原始菌相比下降了4～32倍，而使adeC失活时，菌株的耐药特性与原始菌相比无区别。这说明adeC对于鲍曼不动杆菌的adeABC外排系统来说不是必需的[14]。

结果同时表明，鲍曼不动杆菌的adeFGH的过表达可降低其对氟喹诺酮类、β-内酰胺类以及β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂等多种药物的敏感性，但对氨基糖苷类和复方新诺明未造成明显影响。而黄阿莉等[15]的研究表明，临床分离出的鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类和复方新诺明的耐药率分别达到了50.41%和78.13%。这进一步说明，鲍曼不动杆菌存在多种耐药机制，adeFGH外排系统针对的外排底物有其局限性。

综上，本研究表明鲍曼不动杆菌adeFGH外排系统要形成有效的抗生素外排通道，需要adeF、adeG、adeH基因共表达，且鲍曼不动杆菌的adeFGH外排系统针对的外排底物有其局限性，主要针对氟喹诺酮类、β-内酰胺类以及β-内酰胺酶抑制剂等药物。

[参考文献]

[1] 刘昌孝. 当代抗生素发展的挑战与思考[J]. 中国抗生素杂志，2017，42（1）：1-12.

[2] Duin DV，Paterson D. Multidrug resistant bacteria in the community：Trends and lessons learned[J]. Infectious Disease Clinics of North America，2016，30（2）：377-390.

[3] 刘璐璐，牟作峰，杨会香，等. 重症监护病房多重耐药菌感染的现状及综合干预对策[J]. 护理研究，2015，（2）：144-147.

[4] Shankar PR. Book review：Tackling drug-resistant infections globally[J]. Arch Pharma Pract，2016，7（3）：110-111.

[5] Willyard C. The drug-resistant bacteria that pose the greatest health threats[J]. Nature，2017，543（7643）：15.

[6] Zhao SY，Jiang DY，Xu PC，et al. An investigation of drug-resistant Acinetobacter baumannii，infections in a comprehensive hospital of East China[J]. Annals of General Psychiatry，2015，14（1）：7-13.

[7] Modarresi F，Azizi O，Shakibaie MR，et al. Effect of iron on expression of efflux pump（adeABC）and quorum sensing （luxI，luxR） genes in clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J]. Apmis，2015， 123（11）：959-968.

[8] Zhibin L，Yumei C，Yufan C，et al. RND efflux pump and its interrelationship with quorum sensing system[J]. Hereditas，2016，38（10）：894-901.

[9] Ranaweera I，Shrestha U，Ranjana KC，et al. Structural comparison of bacterial multidrug efflux pumps of the major facilitator superfamily[J]. Trends Cell Mol Biol，2015，10：131-140.

[10] 申晓冬. 外排泵介导鲍曼不动杆菌耐药性的研究进展[J].微生物学免疫学进展，2012，40（3）：73-78.

[11] Yoon EJ，Chabane YN，Goussard S，et al. Contribution of resistance-nodulation-cell division efflux systems to antibiotic resistance and biofilm formation in acinetobacter baumannii[J]. Mbio， 2015，6（2）：3983.

[12] Coyne S，Rosenfeld N，Lambert T，et al. Overexpression of resistance-nodulation-cell division pump adeFGH confers multidrug resistance in acinetobacter baumannii[J].Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2010，54（10）：4389-4393.

[13] Sugawara E，Nikaido H. Properties of AdeABC and AdeIJK efflux systems of acinetobacter baumannii compared with those of the AcrAB-TolC system of escherichia coli[J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2014，58（12）：7250-7257.

[14] Wieczorek P，Sacha P，Hauschild T，et al. Multidrug resistant Acinetobacter baumannii-the role of AdeABC（RND family）efflux pump in resistance to antibiotics[J]. Folia Histochemica Et Cytobiologica， 2008，46（3）：257-267.

[15] 黃阿莉，王宏颖. 233株鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药性分析[J]. 中国实验诊断学，2011，15（11）：1963-1964.

（收稿日期：2018-08-17）