炎症因子在新生儿缺氧缺血性脑病大鼠脑组织中的表达及意义

曾志涌 卢顺玉 黎云鹏

[摘要] 目的 探讨炎症因子在新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）大鼠脑组织中的表达及意义。 方法 36只新生SD大鼠，随机分为对照组、缺血缺氧0 h、6 h、1 d、3 d、7 d组，每组6只。观察各组大鼠脑组织中 TNF-α、CXCL10、CXCL12、 IL-1α、IL-1β、IL-1R mRNA表达差异。 结果 TNF-α在HIE发生后开始增高，6～24 h达到高峰后逐渐下降，72 h仍高于正常，而后下降，但仍高于对照组，至7 d后呈现低表达。CXCL10/12在0 h时表达与对照组对比未见差异，在6 h及12 h达到高峰，至72 h逐渐下降但仍高于对照组，至7 d时基本降至正常。相对对照组，IL-1R 在整个HIE过程中未见明显高表达，而在疾病的初期及恢复期其发病早期却出乎意料的呈现低表达的特点（0 h、24 h、72 h），至7 d后恢复正常。IL-1α、IL-1β在0 h时期呈现低表达，6 h呈现高表达，而后在24 h后恢复正常，至7 d后IL-1α复又呈现低表达趋势。 结论 炎症因子与HIE发病进展密切相关，并且在疾病的不同进程中各种炎症因子起着不同的作用，可以作为判断疾病进展的客观指标。

[关键词] 新生儿缺血缺氧性脑病；TNF-α；CXCL；白细胞介素

[中图分类号] R722.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）28-0038-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of inflammatory factors in the brain tissues of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy（HIE）. Methods 36 newborn SD rats were randomly divided into control group， and hypoxic-ischemic 0 h， 6 h， 1 d， 3 d， 7 d groups， with 6 rats in each group. The differences in the expressions of TNF-α， CXCL10， CXCL12， IL-1α， IL-1β and IL-1R mRNA were observed in the brain tissues of rats in each group. Results TNF-α was increased after HIE， peaked at 6-24 h and was then decreased， and was still higher than normal at 72 h， and was then decreased. However， it was still higher than the control group and showed low expression after 7 d. There was no difference in CXCL10/12 expression at 0 h compared with the control group， peaked at 6 h and 12 h， and was gradually decreased at 72 h but still higher than the control group. It was basically decreased to normal at 7 d. Compared with the control group， IL-1R did not show significant high expression during the whole HIE process. In the early stage of the disease and in the stage of recovery， it unexpectedly showed low expression （0 h， 24 h， 72 h） at the early stage of onset， and returned to normal after 7 d. IL-1α and IL-1β showed low expression at 0 h but turned to high expression at 6 h， and then returned to normal after 24 h， but IL-1α showed a low expression trend after 7 d. Conclusion Inflammatory factors are closely related to the progression of HIE， and various inflammatory factors play different roles in different processes of the disease， which can be used as an objective indicator to judge disease progression.

[Key words] Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy （HIE）； TNF-α； CXCL； Interleukin

新生兒缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）指围产期新生儿因缺氧引起的脑部病变，主要由宫内窘迫、新生儿窒息缺氧引起，是造成新生儿死亡和不同程度的智力低下、脑瘫等神经系统发育障碍的主要原因[1，2]。HIE发病机制及脑损害后神经重塑机制一直未明[3，4]。有研究证明，炎症因子参与HIE的免疫损伤及神经重塑，炎症因子表达与疾病发展程度相关亦与神经系统损伤程度密切相关[5，6]。本研究采取更为准确的实验方法检测炎症因子的表达及动态观察不同时间段的表达，为以后的临床检测、治疗及下一步在分子学及细胞学研究提供研究基础及可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

36只新生SD大鼠，雌雄不限，体重12～20 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK （粤）2013-002。随机分为6组，即对照组、缺血缺氧0 h组、缺血缺氧6 h组、缺血缺氧1 d组、缺血缺氧3 d组、缺血缺氧7 d组，每组6只。

1.2 仪器和试剂

定量PCR仪、反转录试剂盒、定量PCR试剂盒（美国ABI公司）、引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HIE模型建立 参照改良Rice-Vannuncci法[7]建立模型，在乙醚吸入麻醉狀态下，消毒切开颈部皮肤分离右侧颈总动脉结扎剪断，缝合切口，术后放入37℃恒温箱中30 min，以1.5 L/min输入含8% O2和92% N2的低氧气源2.5 h。对照组仅给予假手术处理。

1.3.2 样本采集 分别于造模后0 h、6 h、1 d、3 d、7 d处死大鼠，剪下头颅，沿头颅中线剪开皮肤和颅骨，取出脑组织，-80℃保存备用。

1.3.3 荧光实时定量PCR 采用荧光实时定量PCR检测脑组织中炎症因子mRNA表达。样品抽提后，获得的RNA溶液保存于-70°C。采用紫外吸收法对提取的RNA样品进行变性琼脂糖凝胶电泳以检测提取质量。合成的互补脱氧核苷酸（complementary DNA，cDNA）用于实时定量聚合酶链反应，进行Realtime PCR反应。实验步骤：（1）cDNA第一链合成：从-80℃冰箱中取出RNA，在4℃下解冻，然后在0.2 mL PCR管中配制反应溶液：5%RTBuff 4 μL；Enzyme Mix 1 μL；Prime Mix 1 μL；RNA template（0.5 μg）+H2O 14 μL。将PCR管置于37℃孵育15 min，98℃变性5 min，4℃保温。（2）SYBR Green qPCR：在1.5 mL离心管中配置反应混合液（96孔板）：2×SYBR Green PCR buffer 5 μL；Forward primer（10 μM） 0.5 μL；Reverse primer（10 μM）0.5 μL；template 5 ng；ddH2O约4 μL至总体积10 μL。将PCR管子置于PCR仪中进行反应，50℃孵育2 min，然后95℃，10 min；接着进行40个循环（95℃，15 s；60℃，1 min），最后添加溶解曲线。为了建立PCR产物的溶解曲线，扩增反应结束后。引物序列见表1。

1.4 统计学分析

采用SPSS15.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析、配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。各样品的目的mRNA和内参（U6）分别进行Realtime PCR反应，数据采用2-△△CT法进行分析。

2 结果

TNF-α在HIE发生后半小时内开始增高，6～24 h达到高峰后下降，72 h仍高于正常（P<0.05），但已下降明显（P<0.05）却仍高于对照组，至7 d后已经呈现低表达（P<0.05）。CXCL10/12在0 h时表达与对照组比较未见差异，在6 h及12 h达到高峰，至72 h逐渐下降但仍高于对照组（P<0.05），至7 d时基本降至正常。相较对照组，IL-1R在整个HIE过程中未见明显高表达，而在疾病初期及恢复期其发病早期却出乎意料地呈现低表达的特点（0 h、24 h、72 h，P<0.05），直到后期7 d后才恢复正常。IL-1α、IL-1β在0 h时期呈现低表达（P<0.05），6 h呈现高表达（P<0.05），而后在24 h后恢复正常，但是至7 d后IL-1α复又出现低表达趋势。缺氧初期（0 h）除了TNF-α和CXCL12高表达外（P<0.01），其他的炎症因子呈低表达，而至HIE的高峰期（6 h、24 h）除外IL-1R的炎症因子一致高表达（P<0.01）。见表2。

3讨论

HIE是围产期窒息导致的缺氧缺血性脑损害，HIE脑损害后免疫机制及神经重塑机制一直并不明确，目前大量研究表明免疫损伤在HIE的致病中起着重要作用，免疫因子的表达也与神经系统的损伤程度及疾病进展密切相关。TNF-α是一种具有广泛生物学活性的多肽调节因子[8，9]。可由单核细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞及神经元等分泌。在脑缺血缺氧、脑水肿等刺激下，TNF-α大量分泌并活化星状细胞中的核因子κB（nuelear factor κB，NF-κB），后者与其他促炎性因子发挥协同作用，加重机体炎性损伤并进一步促进 TNF-α的释放，并可通过caspase途径介导细胞凋亡，直接促进神经元萎缩和变性[10，11]。本研究结果显示，TNF-α在HIE发生后半小时内开始增高，6～24 h达到高峰后逐渐下降，至7 d后基本恢复正常，其与HIE的疾病临床进展分期基本一致，可以用来判断疾病的进展及预后。CXCL趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移。CXCL10、CXCL11都属于CXC家族的趋化因子，是淋巴细胞的高效趋化剂，能通过与CD4+T细胞上的CXCR3等结合，介导细胞的趋化募集，对中性粒细胞则没有趋化作用[12-15]。本研究结果显示，CXCL10/12则主要在6 h及12 h达到高峰，说明其可以作为判断疾病的严重程度及炎症反应程度的指标。白细胞介素-1家族（interleukin-1 family，IL-1F）有11个成员，IL-1α、IL-1β、IL-1R是其经典家族成员，其受体、信号传导和功能已经得到了广泛而深入的研究，是促炎性细胞因子，主要通过刺激炎症和自身免疫病相关基因的表达，诱导环氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合酶、干扰素γ、黏附分子等效应蛋白的表达，在免疫调节及炎症进程中扮演着重要角色[16-20]。本研究结果显示，IL-1R全过程低表达，只有IL-1α、IL-1β在6 h时高表达，说明HIE的炎症反应可能主要是INF及CXCL介导的。值得注意的是，除了TNF-α和CXCL12早期是升高的，其他的炎症因子均表达下降，说明TNF-α可以作为早期发病的指标。

本研究结果提示炎症因子基本表达规律为：HIE发生后除外TNF-α，其他炎症因子就迅速开始表达下降，而后迅速在6～24 h上升到达高峰，然后在72 h后逐渐下降，至HIE发生7 d后基本恢复正常，这些结果说明炎症因子参与的炎症反应贯穿着HIE的整个病程，并且不同的炎症因子在因子过程可能扮演了不同的角色来参与炎症过程，为我们下一步研究HIE的分子机制打下基础，可以更好的结合临床及其表达的时间点来选择研究动物模型及患者的时间段，结合本研究结果，从炎症因子的表达时间段来看0 h、6～24 h、72 h比较符合HIE临床特点的研究切入点。由于大鼠和人的对应时间不一致性，HIE模型鼠6～24 h大致和人HIE发生后3～7 d一致，众所周知，HIE的脑水肿及炎症疾病严重的最高峰正是3～7 d，我们发现6个炎症因子除外IL-1R外普遍都在6～24 h高度表达，这与我们临床观察HIE患者在3～5 d是脑损害等临床表现最为严重的临床过程非常符合，提示我们应重视在这个临床阶段进行相应的免疫治疗。

综上所述，炎症因子与新生儿缺血缺氧性脑病发病进展密切相关，并且在疾病的不同进程中各种炎症因子起着不同作用，可以作为判断疾病进展的客观指标。

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（收稿日期：2018-07-03）