重症肌无力相关抗体及检测方法研究进展

雷国华 刘建军 李尊波

[摘要] 重症肌无力是抗体介导、累及神经-肌肉接头的获得性自身免疫性疾病，除了常见的乙酰胆碱受体抗体及肌肉特异性酪氨酸激酶抗体外，重症肌无力还存在其他临床少见抗体；通过对重症肌无力中出现的多种相关抗体及检测方法分析，提高对该疾病的进一步认识。

[关键词] 重症肌无力；连接素抗体；兰尼碱受体抗体；放射免疫法；荧光细胞染色方法

[中图分类号] R746.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）05-0165-04

[Abstract] Myasthenia gravis is an antibody-mediated acquired autoimmune disease， which involves in neuromuscular junctions. In addition to common acetylcholine receptor antibodies and muscle-specific tyrosine kinase antibodies， there are other clinically rare antibodies of myasthenia gravis. Through the analysis of a variety of myasthenia gravis related antibodies and detection methods， further understanding of the disease is improved.

[Key words] Myasthenia gravis； Catenin antibody； Raney-base receptor antibody； Radioimmunoassay； Fluorescent cell staining

重癥肌无力（myasthenia gravis，MG）主要是由乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab） 介导、累及神经-肌肉接头的获得性自身免疫性疾病。全身型MG患者中约80%可检测出AChR-Ab，仅有不足10%的MG患者肌肉特异性酪氨酸激酶抗体（muscle-specific tyrosine kinase，MuSK）阳性[1]，但是，仍有小部分MG患者血清AChR-Ab和MuSK-Ab均呈阴性，这部分MG被称之为血清双阴性重症肌无力[2]。随着检测方法的不断提高，血清双阴性MG患者中发现了多种MG相关抗体，现主要对MG临床少见抗体及检测方法进行总结，提高对该疾病的进一步认识。

1 MG相关抗体

1.1 常见抗体

20世纪70年代Lindstrom等[3]在85%MG患者的血清中检测到AChR-Ab，从而确立了MG在B细胞介导的自身免疫性疾病中的地位。2001年Hoch W等[4]在70%AChR-Ab阴性MG患者的血清中发现了MuSK-Ab。AChR-Ab主要有IgG1和IgG3亚类，其通过补体介导的突触后膜损伤，受体胞吞以及AChR阻滞作用产生严重的AChR损失[5]，MuSK-Ab为IgG4亚类，其不激活补充，主要是与低密度脂蛋白受体相关蛋白4（low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4）相互作用，从而抑制蛋白依赖性的AChR聚簇[6]。LRP4 又被称为多表皮生长因子样域7（multiple epidermal growth factor-like domains 7，MEGF7），2011年，Higuchi O等[7]首次在dSN-MG患者血清中检测出了LRP4-Ab，LRP4-Ab属于IgG，过去一直认为LRP4 与脂质代谢、肢体发育等有关[8]。近年来研究发现，其通过抑制神经元释放的Agrin与胞外LRP4的结合，使得Agrin-LRP4-MuSK信号传导通路破坏而致病[9]。然而，MG发病中，AChR-Ab损害突触后膜，PsmR-Ab通过抑制突触前膜慢K+通道，使得突触前膜的动作电位时程延长，导致乙酰胆碱囊泡迁移及释放改变，从而影响肌纤维兴奋收缩的发生，最终导致信号释放阶段的障碍。

1.2 柠檬酸提取物相关抗体（CAE-Ab）和连接素抗体（Titin-Ab）

60年代初人们利用免疫荧光技术发现在MG患者血清中含有与骨骼肌横纹肌切片交叉着色的一种自身抗体，其后证明了胸腺的肌样细胞与该抗体反应[10]。柠檬酸提取物相关抗体（citric acid extract antibody，CAE-Ab），存在于胸腺、骨胳肌及心肌。1981年，Aarli JA等[11]在胸腺瘤MG患者的血清样品发现能与MG患者产生反应的骨骼肌柠檬酸提取物抗原成分为Titin蛋白，该蛋白又称连接素，是骨骼肌和心肌中除粗细肌原纤维之外的第3种结构蛋白，该蛋白长约1 μm，由27000个氨基酸组成。Titin蛋白特殊的排列方式可增强肌节的稳定性、静止张力。随后，Gautel M等[12]证实Titin蛋白的主要免疫原性区域被称为titin-30，位于A/I带交界区，另一个免疫原性区域位于N1和N2之间。近年来，连接素抗体（titin antibody，Titin-Ab）被认为是MGT患者血清中重要的自身抗体之一。MG与胸腺功能紊乱之间存在相互关系，约75%MG患者存在不同程度的胸腺异常[13]。CAE-Ab多见于MGT，黄载慧等[14]利用ELISA方法检测CEA-Ab及Titin-Ab两种抗体诊断MGT，结果显示对于诊断同一病理类型MGT敏感性及同一种Osserman分型抗体阳性检出率无明显差异。武茜等[15]研究发现CAE-Ab对MGT发病具有显著相关性，前纵隔肿瘤患者术前检测CAE-Ab结合CT检查，可提高诊断胸腺疾病的敏感性。

1.3 二氢吡啶受体抗体（DHPR-Ab）与兰尼碱受体抗体（RYR-Ab）

二氢吡啶受体（dihydropyridine receptor，DHPR）是细胞膜上的L型电压门控钙离子通道和电压感受器，骨骼肌、心肌中含量较高。Maruta T等[16]研究了MG患者与兴奋-收缩（excitation-contraction coupling，E-C）偶联有关的自身抗体，在37%的胸腺瘤MG患者中检测到DHPR-Ab。兰尼碱受体（ryanodine receptor，RyR）是位于肌质网中的钙通道蛋白，因能和一种植物碱Ryanodine结合而命名，其有骨骼肌（RyR1）和心肌（RyR2）两种形式，MG患者的RyR-Ab与两者均可反应。RyR是由4个同源亚基组成四聚体，是一种含有5035个氨基酸，分子量为565 kDa的蛋白质，RyR主要在横纹肌组织中表达，上皮组织和神经元中也可出现。肌膜去极化电位通过T管到达肌质网的终端池，诱导RyR的构象变化，使钙内流，从而触发骨骼肌细胞收缩[17]。RyR-Ab可减弱这种作用，可能是由于胸腺的部分RyR与之产生反应从而使T细胞致敏，进一步刺激B细胞产生RyR-Ab，骨骼肌不能有效收缩而导致肌无力。有研究显示[18]骨骼肌中DHPR和RyR的信号转导为双向的，两者之间机械和化学的双向偶联机制是E-C的基础。除神经肌肉的传导异常，MG与肌肉的兴奋收缩偶联受损相关，DHPR-Ab是伴胸腺瘤的MG的又一个新标志，可能与肌肉的兴奋收缩耦联有关。

1.4 电压门控性钾通道抗体（Kv-Ab）

Kv抗体常见的有Kvl.1、Kvl.2或Kvl.6，而抗Kvl.4抗体主要存在于骨骼肌、心肌及脑中。Suzuki S等[19]在2005年利用兔耳肌细胞提取物作为抗原来源，S35标记的横纹肌肉瘤细胞中发现Kvl.4抗体，924例MG患者中发现8例（男1例，女7例）发展为炎症性肌病，但存在非肌炎特异的自身抗体，其中3例患者发现抗Kvl.4抗体。MG相关的炎症性肌病的临床和免疫学特征与多发性肌炎不同，首先，心肌受累和胸腺瘤在多发性肌炎中并不常见[20]。其次，MG患者相关的炎症性肌病的自身抗体与多发性肌炎患者中的肌炎特异性自身抗不同[21]。Kvl.4抗体阳性的MG患者易发生延髓型肌无力、胸腺瘤及心肌炎。目前关于Kvl.4抗体的MG的报道较少，其在MG发病机制中的作用尚需进一步探讨。

1.5其他更少见抗体

MG还可出现胶原蛋白XIII抗体、聚蛋白抗体、DHPR-Ab、抗补体C5-Ab、HSP70-65-Ab、IFN抗体[22]等临床少见抗体。值得注意的是：①IFN抗体在MG伴胸腺瘤患者外周血中水平较高，IFN具有抗肿瘤作用，并且具有多生物学效应，主要由白细胞、成纤维细胞产生的一种细胞因子[23]。②胶原蛋白是称为MACITs（具有间断的三螺旋的膜相关的胶原蛋白）的胶原亚组的成员，由短的胞质结构域、单个跨膜结构域和大部分的胶原胞外域组成[24]。胶原蛋白是神经肌肉接头成熟所需的跨膜蛋白。最近的研究表明胶原蛋白位于神经肌肉接头的功能区，结合乙酰胆碱酯酶相关胶原蛋白（ColQ），并有助于神经肌肉接头的乙酰胆碱酯酶的分布形式。因此，我们推测胶原蛋白自身抗体的致病机制可能是阻碍胶原蛋白和其他突触基底层组分之间的相互作用，并使神经肌肉接头突触不稳定[25]。

2 检测方法

2.1 放射免疫法（radioimmunoprecipiation assay：RIA）

RIA又叫做竞争性饱和法，抗原和抗体由放射性物质标记，随之结合待检样本，形成抗原抗体复合物进行测定。以往的放射免疫测定方法关键在于竞争结合特异性抗体，竞争双方为放射性标记的抗原与待检样本中未标记的抗原；另一种方法是在前者的基础上扩展，关键在于放射性物质标记足量抗体，结合待检抗原，利用固相免疫吸附载体的原理的一种非竞争放射免疫分析法。RIA优势在于特异性强、灵敏度高、可一次完成大量样本的检测、血清的消耗量少。国外研究多采用敏感度和特异度均高的RIA检测AChR-Ab的滴度[26]，尤其是类似MG症状的初步筛选时，RIA应用更广泛。

2.2 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA法其本质是一种特异性化学发光反应，优势在于该方法利用高度特异性抗原抗体结合，可以有效消除样本的本底和对位量干扰，得到更高的灵敏度。目前，ELISA法可实现全自动化，減少了系统及随机误差，因此广泛应用于MG抗体检测中。但是，该法易受多方面因素的干扰：①代谢物，测定易出现交叉反应，干扰生物利用度；②抗体的形成，对蛋白的定量测定产生影响；③基质特异性，蛋白的反应性易改变。因此，国内外多推荐利用特异度和灵敏度均高的RIA检测抗体及其滴度。

2.3 荧光细胞染色方法（cell-based assays，CBA）

CBA原理在于通过编码蛋白的互补DNA（cDNA）转染活的人胚胎肾（HEK）细胞，同时与细胞内锚定蛋白rapsyn共同表达，从而使得AChR在HEK细胞表面上表达。测定AChR-Ab时，可用AChR亚基的cDNAs以及rapsyn增强的绿色荧光蛋白转染HEK细胞。测定LRP4-Ab时，用LRP的cDNAs转染HEK细胞来增强细胞表面表达。CBA的优势在于可检测生物膜环境中的AChR结合的抗体，这些抗体具有天然构象状态和适当的糖基化水平，与神经肌肉接头处的抗体类似。因此，CBA可提高血清阴性MG患者的抗体检测的阳性率。CBA高敏感性很可能是由于其检测到的抗体通过二价结合使细胞表面上的AChR簇交联作用，从而增加了CBA检测抗体的敏感性。但是CBA的劣势在于，它需使用活细胞，需组织培养设备，成本高，耗时长，目前主要应用于专门的研究中心[27]。

2.4 時间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）

MG患者中AChR-Ab可通过放射免疫沉淀测定，为研究一种非放射性免疫测定法，人们建立了一种镧系元素的高灵敏度检测，可标记多种化合物。TRFIA使用Eu3+-a-CTx而不是125I-a-BuTx标记的抗原[28]。其优势在于用于标记抗原的试剂是比125 I-a-BuTx更稳定，克服了酶不稳定性及RIA中放射性同位素的污染问题，但是，要求专业的实验设备，限制了该方法的广泛应用。

MG是临床少见疾病，同其他自身免疫疾病一样，其发病的分子机制错综复杂，自身抗体与MG的发病机制密不可分，已发现MG相关抗体十余种，是否还存在与MG相关的抗体仍在探索，目前存在许多问题需进一步解决，如自身抗体之间的信号转导是如何启动和调节自身免疫应答等，随着对于MG的深入研究将会有更新的进展；国内外多推荐利用特异度和灵敏度均高的RIA检测抗体及其滴度，提高检测抗体的准确性以及扩展检测方法，从而更好地去认识MG这一疾病。

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（收稿日期：2017-12-21）