肝组织及血清中的Ang Ⅱ、TGF—β1在慢乙肝肝纤维化中的作用研究

方佩佩+潘陈为+诸葛璐+林秀珍+金玲湘

[摘要] 目的 探讨肝组织及血清中AngⅡ、TGF-β1的表达与不同程度慢乙肝患者肝纤维化的关系。 方法 选取2015年1月～2016年12月在本院住院的丙氨酸氨基转移酶（ALT）1～2倍升高的慢性HBV感染患者50例，均行肝穿刺活检术。根据Metavir评分系统进行组织学活动度（histologic activity，A）和纤维化分期（fibrosis，F）评分，将其分为轻度纤维化组（

[关键词] AngⅡ；TGF-β1；肝星状细胞；肝纤维化

[中图分类号] R512.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）35-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of AngII and TGF-β1 in liver tissue and serum and its relationship with chronic hepatitis B hepatic fibrosis with different degrees. Methods 50 patients with chronic HBV hospitalized in our hospital whose ALT was increased by 1-2 times from January 2016 to December 2016 were selected. Liver biopsy was performed in all patients. According to the Metavir scoring system， scores of histologic activity（A） and fibrosis staging （F） were calculated， and the patients were divided into mild fibrosis group（

[Key words] AngII； TGF-β1； Hepatic stellate cell； Liver fibrosis

众所周知，我国是个乙肝大国，1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18%，与肝纤维化相关的肝硬化及肝细胞癌现已成为严重的社会和公共卫生问题[1]。肝纤维化是肝脏中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）增生与降解失衡，导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的结果[2]，其中肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化的细胞学基础[3]。转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）使HSC激活，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1与HSC激活之间的恶性循环[4]。近年研究发现，肝脏中存在完整的RAAS生化链，且与肝纤维化密切相关。当肝脏受到各种损伤因子作用时，血管紧张素（angiotensin，Ang）Ⅱ可通过增加HSC TGF-β1的表达促进HSC活化[5]。因此，從TGF-β1及AngⅡ信号通路研究乙肝引起的肝纤维化将是一个全新可行的方向。本研究对比分析不同程度纤维化的慢乙肝患者血清及肝脏AngⅡ、TGF-β1的水平，进一步探讨AngⅡ、TGF-β1与肝纤维化的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月～2016年12月本院住院的慢性HBV感染患者50例。入选标准：（1）HBsAg阳性≥6个月；（2）HBV DNA≥105 IU/mL；（3）丙氨酸氨基转移酶（ALT）1～2倍升高（我院ALT正常范围9～50 U/L）。排除标准：（1）合并其他病原体感染或药物、酒精、免疫、中毒、遗传代谢等其他因素所致的ALT升高；（2）合并有高血压、糖尿病、肾功能不全或近期使用ACEI、ARB类药物等可能干扰RAS系统的患者。所有的患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 肝穿刺活检术 50例患者均行超声定位下肝穿刺活检术，肝活检组织检查采用单人操作法，选择16G活组织检查穿刺针，经B超实时定位下，经皮快速穿刺获取肝组织。获取的肝组织必须在2 cm以上（至少包括3个以上汇管区）。肝脏组织病理HE染色：观察患者肝脏炎症活动度和纤维化程度。根据Metavir评分系统中的组织学活动度（histologic activity，A）和纤维化分期（fibrosis，F）标准（详见2015年《慢性乙型肝炎防治指南》）[1]，将患者分为两组，其中轻度肝纤维化组28例（mild fibrosis，MF组，Metavir评分

1.2.2 血清学检测方法 血清TGF-β1，Ang Ⅱ采用ELISA法，HBV血清标志HBsAg、AntiHBs、HBeAg、AntiHBe、AntiHBc检测采用ELISA法，HBV DNA采用荧光定量PCR法，血清ALT、AST、肝纤维化4项指标、AFP等测定采用自动生化分析仪。

1.2.3 免疫组化法 观察TGF-β1、Ang Ⅱ在患者肝组织中的分布及其关系：所有肝组织样本均予10%甲醛固定，石蜡包埋，蜡块连续切片3张，分别予TGF-β1及Ang Ⅱ免疫组化法染色。切片每张厚度约4 μm，免疫组化染色采用SP法，严格按照说明书操作。用已知阳性组织切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液（PBS）替代一抗作为阴性对照。TGF-β1、Ang Ⅱ评分通过染色强度及阳性细胞百分比进行综合评分：每张切片在高倍镜下随机选取10个视野，采用半定量评分法。根据细胞的染色面积及染色强度进行综合评分。染色面积评分：无细胞染色为0分，<25%细胞染色为1分，25%～50%细胞染色为2分，>50%细胞染色为3分；染色强度：0分，无色；1分，染色弱但明显强于阴性对照；2分，染色清晰，中等程度；3分，染色程度强。按照两者积分相加进行评定：0～1分为（-），1～2分为（+），3～4分为（++），5～6分为（+++），（++～+++）定为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS14.0版统计学软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料与生化学检查结果比较

50例入选患者，根据肝活检结果分为：（1）MF组共28例，其中男18例，女10例，年龄21～38岁，平均（29.25±6.25）岁。（2）AF組共22例，其中男15例，女7例，年龄24～36岁，平均（32.5±7.5）岁。两组间年龄、性别差异无统计学意义（P>0.05）。肝功能、HBV DNA等结果见表1。

2.2 两组血清肝纤维化指标结果比较

血清肝纤维化：透明质酸、层粘连蛋白、三型前胶原这三个指标，AF组均显示高于MF组（P<0.05）。而四型胶原MF组与AF组间差异无统计学意义。见表2。

2.3 两组血清Ang Ⅱ及TGF-β1水平比较

MF组与AF组Ang Ⅱ水平分别为（26.2±15.60）U/L和（48.4±19.55）U/L。MF组与AF组TGF-β1水平分别为（20.55±10.62）ng/mL和（25.65±14.45）ng/mL。AF组血清Ang Ⅱ及TGF-β1显著高于MF组（P<0.05）。见表3。

2.4 肝组织免疫组化学分析

Ang Ⅱ及TGF-β1阳性为胞浆型，呈黄色或棕黄色（封三图1）。随着纤维化程度加深，Ang Ⅱ及TGF-β1阳性表达呈递增趋势。

3 讨论

肝纤维化是乙肝发展为肝硬化必经的病理过程，由于肝脏中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）增生与降解失衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的结果。其中肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纤维化的细胞学基础，其活化是肝纤维化形成的开端[6]。HSC活化受一系列细胞信息分子和细胞内信号转导的调控，作用于这些信号及其转导过程或阻断这些信号转导级联反应的主要环节，已成为防治肝纤维化的重要策略[7]。

长期以来，肝穿刺活检一直作为诊断肝纤维化的金标准。但由于肝活检是一种创伤性检查，存在一定风险，且受标本误差的影响。尽管慢性肝炎、肝纤维化是肝脏弥漫性病变，但其病变的程度分布不均匀，1份肝活检标本仅占肝脏的1/100000～1/50000，难免存在样本的误差[8]。因此亟需发现可以早期协助诊断肝纤维化的指标。有研究表明，慢乙肝患者血浆ACE的水平可作为肝纤维早期指标[9]。

传统的观念认为：肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiotension-aldosterone System，RAAS）是一个循环的内分泌系统。近年陆续研究发现，肝脏中也存在完整的RAAS生化链，且与肝纤维化密切相关[10]。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin，Ang Ⅱ）是RAAS系统的主要生物活性物质，它需与细胞膜上的Ang受体（ATR）结合后才能发挥作用[11]。AngⅡ主要通过以下信号转导途径将上游信号传递至下游的应答分子：（1）AngⅡ与AT1R结合后，使ERK和c-jun磷酸化，从而激活Ras/ERK信号通路[12]；（2）AngⅡ通过激活还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶，产生活性氧簇，进一步激活Ras/ERK、PI3K/Akt 等信号通路；（3）AngⅡ还可使细胞内Ca2+浓度升高，调节细胞内pH传递信号[13]。当肝脏受到各种损伤因子作用时，AngⅡ除通过上述信号通路使HSC活化外，还可通过增加HSC的TGF β1表达促进HSC激活[14]。

轉化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）作为TGF-β家族中的重要组成成员，在肝纤维化的发生、发展中起着至关重要的作用，是目前公认的最强的致纤维化细胞因子[15]。Akpolat等[16]运用免疫组化方法对CHB患者肝组织中TGF-β1分布和含量进行分析，发现正常肝组织中TGF-β1表达量极少，但肝纤维化时可在肝窦内皮细胞、纤维间隔等部位表达，并且其含量与肝纤维化程度呈正相关，这与国内外大量相关研究结论一致。HSC激活成为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）进而产生大量ECM是形成肝纤维化的中心环节[17]。TGF-β1可直接作用于HSC或通过诱导HSC表达血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等细胞因子受体使HSC激活为MFB，导致ECM的合成和分泌能力增加，而HSC激活后又可分泌TGF-β1，形成TGF-β1与HSC激活之间的恶性循环，使ECM生成进一步增多[18-20]。

本研究通过肝脏病理活检显示，Metavir评分较高者，其纤维化程度较高的，相对应的血清及肝脏中AngⅡ、TGF-β1水平也较高。由此提示AngⅡ、TGF-β1参与了肝脏纤维化进程。相较于肝穿刺活检的有创风险及标本误差，检测血清AngⅡ、TGF-β1水平则安全、快速、简便，这提示RAAS信号通路及TGF-β1有可能成为防治肝纤维化的一个重要靶点。

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（收稿日期：2017-07-14）endprint