非酒精性脂肪肝患者血清miR—122的表达

肖琳　麦丽娟　麦群弟

[摘要] 目的 探讨非酒精性脂肪肝（NAFLD）患者血清miR-122的表达水平，探索新的诊断NAFLD的生物学标记。方法 选择临床确诊的NAFLD患者48例，健康对照组48例。留取血清，用实时荧光定量PCR方法检测血清miR-122的表达。统计学分析miR-122在两组间表达水平的差异。 结果 NAFLD患者血清miR-122的表达水平较对照组明显升高（P<0.01）。 结论 miR-122可能参与了NAFLD的发病机制，有可能成为NAFLD新的诊断标记物。

[关键词] NAFLD；miR-122；诊断；标记物

[中图分类号] R575.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）28-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the expression of serum miR-122 in patients with nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， and to explore the new dagnostic biomarkers of NAFLD. Methods 48 patients with clinically diagnosed NAFLD and 48 healthy controls were selected. Their serum specimens were taken. The difference in expression levels of miR-122 between the two groups was statistically analyzed. Results The expression level of serum miR-122 in NAFLD patients was significantly higher than that in control group（P<0.01）. Conclusion miR-122 may be involved in the pathogenesis of NAFLD and may become a new diagnostic marker for NAFLD.

[Key words] NAFLD； MiR-122； Diagnosis； Marker

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝功能酶學异常和慢性肝病常见的原因之一，以肝细胞内脂肪过度沉积为主要的病理特征。在西方发达国家流行率很高，据报道成人NAFLD患病率为20%～33%[1-2]。在我国，随着生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖症和代谢综合征的发生率呈逐年上升趋势。一些经济发达地区如广州、上海、香港等地成人NAFLD患病率达到15%[3]。NAFLD可增加患心血管疾病、2型糖尿病及代谢综合征的风险，患病人群广泛，临床表现隐匿，呈多系统受累，缺乏特效的治疗药物。重度NAFLD可发展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），约有20%进展为肝纤维化和肝硬化。目前我国NAFLD的患病率逐年上升，并有年轻化态势，因此探索无创的、简便易行的用于诊断及预测疾病严重程度的生物学指标具有重要的意义。

miRNA是近年发现的新的转录后调控基因，长约18～25个核苷酸，是内源性、非编码的小RNA分子[4]，广泛存在于哺乳动物体内，通过与靶mRNA的3-UTR碱基配对，抑制mRNA的翻译或直接使mRNA降解，从而对细胞和基因的多种行为进行控制，如打开和关闭基因、删除一些不需要的DNA片段、抑制同源的mRNA的表达等。目前认为miRNAs在生物的生长发育过程中发挥着重要作用，通过对基因转录后水平的调控，miRNAs参与机体的生理及病理过程，与许多疾病的发病机制有关。本研究的目的旨在揭示miR-122在NAFLD发病机制中的作用，探索一种新的简便易行的生物学标记用于诊断NAFLD，为寻找治疗NAFLD的药物作用靶点奠定基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年5月～2015年5月本院门诊就诊的NAFLD患者48例为实验组，包括男28例，女20例，年龄23～64岁，平均（46.4±1.7）岁；对照组48例，为本院的健康体检人群，排除高血压、高血脂、糖尿病及肝功能异常者。其中男29例，女19例，年龄20～61岁，平均（44.6 ±2.3）岁。NAFLD的诊断标准参考《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[5]。两组患者的一般资料比较，无统计学差异（P>0.05），具有可比性。

1.2 实验室检测

入组人群均取空腹静脉血5 mL，标本离心后取上清液移至Eppendorf管中，-70℃保存备用。采用实时荧光定量PCR法检测两组miR-122的表达情况。按照miRNeasy Serum/Plasma Kit标准操作步骤，提取样本血清中总RNA。qRT-PCR按照miRNA qRT-PCR检测系统操作步骤进行。反应体系为：模板2 μL，特异引物2 μL，SYBR缓冲液10 μL和无RNA酶的灭菌水4 μL。扩增条件：预变性95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15 s，45～70个循环。扩增结束后进入熔解曲线分析。反应体系及反应条件严格按说明书进行。miRNA 水平用阈值循环（Ct 值）表达，采用2-△△Ct法评估miR-122的相对表达量，以2-△Ct代表每组细胞的表达量[6]，并以此为基础进行统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件进行，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。endprint

2 结果

2.1 qRT-PCR结果

按照miRNA qRT-PCR检测系统的操作方法进行实验，绘制miR-122的扩增曲线和溶解曲线见封三图1、2，结果显示目标基因与内参基因的扩增曲线有很好的一致性，溶解曲线呈现一单峰，无非特异性扩增，表明扩增效率较高，特异性较好。

2.2两组血清miR-122的比较

NAFLD组血清miR-122的表达量为（-9.71±2.40）（2-△Ct），对照组血清miR-122的表达量为（-5.55±1.55）（2-△Ct），在NAFLD组血清miR-122的表达水平明显升高，两组比较有统计学差异（P<0.01）。见封三图3。

3 讨论

非酒精性脂肪肝是世界范围内广泛流行的肝脏疾病，在病理进展过程中包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝癌。非酒精性脂肪肝的诊断目前主要依靠肝组织学特征、脂肪变性、肝小叶炎症、气球样变、肝纤维化等。临床很需要一个非侵入性的血清標记物代替组织学诊断。非酒精性脂肪肝的严重程度和进展受到各种因素的影响，如环境因素、遗传因素、表观遗传变异等。近来许多研究显示microRNAs与非酒精性脂肪肝的发生有关。

miR-122 是miRNAs 家族成员之一，是最早发现的具有组织特异性的一种miRNAs，在肝组织高度表达，约占肝组织miRNAs的70%。许多研究发现miR-122在肝脏的生理功能和疾病发生方面都有重要的作用，miR-122表达水平的改变参与调控HCV、HBV感染、非酒精性脂肪性肝病及肝脏肿瘤的发生发展[7]。近年来随着人们生活方式的改变，NAFLD的发生率逐年上升，miR-122在NAFLD中的作用也受到学者们关注。研究发现miR-122是糖和脂质代谢的重要因子，能够促进胆固醇和脂肪酸合成，抑制胆汁酸和脂肪酸氧化，在肝脏脂质代谢调控中发挥广泛作用。Salvoza NC等[8]检测NAFLD患者和健康对照组循环miR-21，miR-34a，miR-122，miR-125b和miR-375的表达水平，结果显示血清miR-34a和miR-122水平在NAFLD患者明显高于健康对照组。ROC工作特征曲线分析显示miR-34a 和 miR-122曲线下面积分别是0.781 和 0.858。Yamada H等[9]用高脂饮食喂养大鼠2～10周，肝脏和血清中甘油三酯明显增加，miR-122水平显著升高，而血清转氨酶活性正常，提示miR-122有益于诊断早期NAFLD，对于监测肝脏疾病优于传统的临床指标。Miyaaki H 等[10]报道血清和肝脏miR-122有明显的相关性，轻度脂肪肝组血清和肝脏miR-122水平相对较低，在轻度纤维化组，肝脏和血清miR-122水平明显高于严重纤维化组，表明血清和肝脏miR-122与肝脏脂肪变性和纤维化有关。国内有学者高金保等[11]研究初步证实在NAFLD患者血清中miR-122、miR-21、miR-34a和miR-451呈高表达，尤以miR-122和miR-34a表达水平较高、提示有可能作为NAFLD诊断的生物学标志。多数研究认为血清miR-122水平与肝脏组织学严重程度有关，可用于早期评价脂肪肝进展及评价非酒精性脂肪性肝炎患者发生肝细胞癌的风险。研究发现在非酒精性脂肪性肝炎患者中，高水平的miR-122表达，不会发生肝细胞癌和进展到严重肝病阶段。也有研究发现在疾病进展到肝纤维化之前miR-122表达水平呈下降趋势。Akuta N等[12]选择36例经组织学证实NAFLD、并且无肝细胞癌的日本籍患者作为研究对象，进行二次肝活检，探讨血清miR-122水平与肝组织学特征的关系。第1次、第2次肝活检的平均时间是4.6年。结果显示，第二次肝活检以后，组织学评分改善的患者，miR-122水平明显降低。血清miR-122水平与肝组织学评分有明显的相关性，而且和肝功能ALT、AST密切相关。

miR-122是肝脏特别是肝细胞中含量最为丰富的miRNA，其靶基因与脂质代谢的调节密切相关。Csak T等[13]通过动物实验在饮食诱导的脂肪性肝炎大鼠和离体的肝细胞中评价miR-122及其靶基因的功能。发现HIF-1α，波形蛋白和MAP3K3是miR-122的靶基因。肝组织中miR-122降低与循环中外泌体丰富及蛋白质丰富的血清miR-122升高相关。肝组织中miR-122降低有助于上调改变组织结构的调节基因（HIF-1α，波形蛋白和MAP3K3）的基因表达，认为其可能在NASH相关肝纤维化的发生机制中起重要作用。

丙型肝炎患者脂肪肝发生率较高，肝细胞脂肪变性是丙型肝炎患者主要的组织学特征。Cermelli S等[14]研究发现在慢性丙型肝炎患者中血清miR-122、miR-34a 和miR-16明显高于对照组，与HCV病毒载量无相关性。同时在NAFLD患者的miR-122、miR-34a 和miR-16也明显高于对照组。在慢性丙型肝炎组和NAFLD组，miR-122、miR-34a均与肝脏纤维化分期、炎症活动度、肝脏酶学指标呈正相关，miR-122与血脂异常也有相关性，认为miR-122参与了脂代谢的调节机制，miR-122是调节胆固醇和脂肪酸的主要因子，可能是慢性丙型肝炎发生脂肪肝的原因之一。Clarke JD等[15]建立蛋氨酸胆碱缺乏小鼠NASH动物模型，造成中毒性肝损伤，miR-122和ALT/AST水平均明显升高，认为miR-122可以作为评价NASH肝损伤的指标。

本研究结果显示，NAFLD组血清miR-122表达量明显高于健康对照组，与上述文献报道一致，提示miR-122可能参与了NAFLD的发病机制，有望成为新的NAFLD的诊断标记和药物作用靶点。还需要扩大样本，根据NAFLD及肝损害的程度分层，进一步验证miR-122的临床诊断价值。

miRNAs作为疾病诊断标记物是近年来的研究热点，但是miRNAs在NAFLD的相关研究中尚存在一些问题，值得深入探讨：（1）相关研究标本量均较少，缺乏更多的大样本的临床研究数据。（2）NAFLD发病因素较多，与代谢综合征密切相关，可以检测到多种miRNAs的分子表达水平的变化，需要明确NAFLD中肝脏特异性的miRNAs。（3）明确NAFLD不同疾病进展阶段、不同疾病严重程度miRNAs表达谱的变化。（4）同一种miRNAs在NAFLD不同疾病过程中的表达水平变化。endprint

[参考文献]

[1] Farrell GC，Larter CZ. Nonalcoholic fatty liver disease：from steatosis to cirrhosis[J]. Hepatology，2006，43（2 Suppl 1）：S99-S112.

[2] De Alwis NM，Day CP. Non-alcoholic fatty liver disease：the mist gradually clears[J].J Hepatol，2008，48（Suppl 1）：S104-S112.

[3] Fan JG，Farrell GC. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China[J].J Hepatol， 2009，50：204-210.

[4] Bladé C1，Baselga-Escudero L，Salvadó MJ，et al. miRNAs，polyphenols，and chronic disease[J].Mol Nutr Food Res，2013，57（1）：58-70.

[5] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2010年修订版）[J].中国医学前沿杂志电子版，2012，4（7）：4-10.

[6] Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T） method[J].Nat Protoc，2008，3（6）：1101-1108.

[7] 杨颖卓，康鹏，高杰，等.肝特异性的miR-122调控肝脏疾病的研究进展[J].临床肝胆病杂志，2014，30（5）：473-477.

[8] Salvoza NC，Klinzing DC，Gopez-Cervantes J，et al. Association of circulating serum miR-34a and miR-122 with dyslipidemia among patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].PLoS One，2016，11（4）：e0153497.

[9] Yamada H，Ohashi K，Suzuki K，et al. Clin chim acta. Longitudinal study of circulating miR-122 in a rat model of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Clinica Chimica Acta，2015，446：267-271.

[10] Miyaaki H，Ichikawa T，Kamo Y，et al. Significance of serum and hepatic microRNA-122 levels in patients with non-alcoholic fatty liver disease[J].Liver Int，2014，34（7）：e302-e307.

[11] 高金保，劉霞.非酒精性脂肪性肝病患者血清中循环microRNAs表达水平及意义[J].中国肝脏病杂志（电子版），2014，6（2）：56-58.

[12] Akuta N， Kawamura Y，Suzuki F，et al. Analysis of association between circulating miR-122 and histopathological features of nonalcoholic fatty liver disease in patients free of hepatocellular carcinoma[J].BMC Gastroenterol，2016，16（1）：141.

[13] Csak T， Bala S， Lippai，et al. microRNA-122 regulates hypoxia-inducible factor-1 and vimentin in hepatocytes and correlates with fibrosis in diet-induced steatohepatitis[J]. Dliver Int，2015，35（2）：532-541.

[14] Cermelli S， Ruggieri A， Marrero JA，et al.Circulating microRNAs in patients with chronic hepatitis C and non-alcoholic fatty liver disease[J].PLoS One，2011，6（8）：e23937.

[15] Clarke JD，Sharapova T，Lake AD，et al. Circulating microRNA 122 in the methionine and choline-deficient mouse model of non-alcoholic steatohepatitis[J].J Appl Toxicol， 2014，34（6）：726-732.

（收稿日期：2017-08-16）endprint