高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物的含量

黄昌兴

（汕头市检验检测中心，广东汕头 515041）

孔雀石绿（Malachite Green，MG），别名孔雀绿、孔雀绿草酸盐、碱性绿、草酸孔雀石绿等，是人工合成的一种三苯甲烷类化学物，可杀真菌、细菌、寄生虫，因其对养殖水域中的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病和寄生虫病等具有良好的疗效，被作为杀菌剂在水产养殖业广泛使用[1-2]。孔雀石绿在鱼体内代谢为隐色孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG），其毒性强于母体孔雀石绿，有强烈的致畸胎、致突变、致癌作用。2002年原农业部颁布的《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》已明文规定孔雀石绿禁止用于所有食品动物。

水产品是汕头当地居民经常食用的食品，水产品养殖更是当地的传统海洋产业之一。因此强化水产品质量安全对于保障消费者生命健康、促进水产品养殖业繁荣发展均具有重要意义。目前，MG及其代谢物LMG的检测方法主要包括分光光度法、酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、液质联用法（Liquid Chromatography-Mass Spectrometer，LC-MS）等[3-5]，其中HPLC因检测成本低、仪器普及率高而被基层检测机构广泛采用。本文建立了高效液相色谱-荧光法检测水产品中MG及其代谢物LMG的方法，以期简化样品前处理过程，提高基层检测机构的检测效率和准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1200型液相色谱-荧光检测器：美国Agilent安捷伦公司；HX-4型均质器：山东欧莱博医疗器械有限公司；TG16G型离心机：常州市亿能实验仪器厂；VOKTEX型涡旋混匀器：海门市贝尔仪器制造有限公司；SN-RE-201D型旋转蒸发仪：上海尚仪仪器设备有限公司；固相萃取装置：德国CNW公司；PRS固相萃取柱：500 mg/3 mL；中性氧化铝固相萃取柱：1 g/3 mL。

孔雀石绿和隐色孔雀石绿，纯度≥98%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈：均为色谱纯；盐酸羟胺、乙酸、对甲苯磺酸、二甘醇和硼氢化钾，均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取适量的MG或LMG标准品，用适量甲醇溶解并定容，配制成浓度为100 mg·L-1的标准溶液，4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

水产品去鳞、去骨、去皮，沿着背脊取可食用部分，粉碎；准确称取样品5.0 g（精度0.1 mg）于50 mL离心管内，依次加入0.1 mol·L-1乙酸铵缓冲液5.0 mL、20%盐酸羟胺1.5 mL、1.0 mol·L-1对甲苯磺酸2.5 mL，用匀质机以10000 r·min-1的速度均质30 s，加入10 mL乙腈涡旋振荡60 s；加入酸性氧化铝10 g，涡旋振荡30 s，6000 r·min-1离心5 min；上清液中加入二甘醇10 mL、乙腈10 mL，涡旋振荡30 s，6000 r·min-1离心5 min；上清液加入1 mL硼氢化钾、15 mL二氯甲烷，涡旋振荡30 s，6000 r·min-1离心5 min，收集下层二氯甲烷溶液；残渣中加入10 mL二氯甲烷重复提取一次，合并二氯甲烷溶液；45 ℃水浴下氮吹浓缩至近干，用5 mL乙腈充分溶解残渣，待净化。

1.3.2 净化

将中性氧化铝固相萃取柱与PRS固相萃取柱连接，PRS固相萃取柱安装在固相萃取装置上，用5 mL乙腈活化萃取柱后，将待净化样品溶液转移至中性氧化铝SPE小柱中净化，弃去流出液；依次加入2 mL初始流动相、1 mL盐酸羟胺甲醇溶液洗脱PRS柱，洗脱液经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：Silversil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-5 mmol·L-1乙酸铵溶液（82∶18）；进样量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；激发波长：265 nm；发射波长：360 nm。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 提取与净化

结合MG和LMG的理化性质，比较了乙酸钠缓冲溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂对水产品中MG和LMG的萃取效率；比较了酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝对水产品中MG和LMG的净化效果。结果表明，乙腈对MG和LMG具有良好的萃取效率，加标回收率在93.4%～97.8%；碱性和酸性氧化铝会吸附目标化合物而降低萃取率，而中性氧化铝固相萃取柱净化，可有效去除提取液中酸性杂质，消除水产品中油脂和基体的干扰，净化效果好，基质干扰小，可有效保护色谱柱和检测器。

2.1.2 流动相的选择

比较了甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-乙酸铵溶液、四丁基溴化钠-乙腈或甲醇等不同流动相种类或比例对MG及其代谢物LMG的色谱分离效果。结果显示，以乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相时，MG和LMG可获得更好的分离效果，且响应信号强，这可能是由于MG及LMG易于在乙腈中溶解，且乙酸铵作为缓冲溶液可提供合适的pH，从而促进其生成正离子；当乙酸铵浓度为5 mmol·L-1时，MG及其代谢物LMG可有效分离，峰形尖锐且对称，出峰时间适中且相对稳定，基线稳定且基质干扰少，色谱图见图1。

图1 MG及其代谢物LMG色谱图

2.2 线性关系及检出限

配制MG和LMG质量浓度为0 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1和20.0 μg·mL-1的混合标准溶液，按本文建立的HPLC法进行测定，以MG和LMG响应值为纵坐标，以MG和LMG质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，在1.0～20.0 μg·mL-1浓度范围内，GM的线性关系方程为y=0.3157x+0.03225，相关系数r为0.9998；LGM的线性关系方程为y=0.4213x+0.02486，相关系数r为0.9999，这表明MG和LMG均具有很好的线性关系。

在空白水产品样品中添加浓度为0.1 μg·kg-1、0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、1.5 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1的系列标准溶液进行测定，以3倍信噪比（S/N）作为方法检出限，10倍信噪比为方法定量限。结果显示，该方法MG和LMG的检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1。

2.3 方法回收率和精密度

分别对秋刀鱼、对虾和螃蟹空白样品进行MG和LMG低、中、高3个水平的加标回收实验，按本文建立的检测方法进行测定，回收率和精密度（RSD）见表1。结果显示，MG和LMG在3个加标水平下的平均回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%，表明本方法具有较好的准确度和精密度。

表1 回收率和精密度（n=6）

2.4 实际样品检测

采用本方法对市售的对虾、螃蟹、鲫鱼等10份水产品逐个进行MG和LMG含量检测，均未检出MG和LMG残留，说明所检10份水产品在养殖过程中均未使用孔雀石绿药物。

3 结论

本文建立了水产品中MG和LMG的高效液相色谱-荧光法测定方法。水产品经乙腈超声提取及中性氧化铝柱净化后，用液相色谱-荧光检测器检测。结果表明，MG和LMG在1.0～20.0 μg·mL-1浓度范围内，均具有很好的线性关系，相关系数≥0.9998；检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为1.5 μg·kg-1；加标回收率为88.1%～96.6%，RSD为0.9%～3.8%。该方法具有较好的准确度和精密度，可满足水产品中MG和LMG含量测定。