UPLC-MS/MS 测定茶叶中草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸残留量

文洋洋

（六安市产品质量监督检验所，安徽六安 237000）

草甘膦（Glyphosate，PMG）是近些年应用最广、产量最大的非选择性广谱除草剂，因其高效、廉价、低毒的特性被广泛应用于花木、茶叶、果树等领域[1]。草铵膦（Glufosinate ammonium，GLUF）具备与草甘膦类似的优点，且因其为触杀型农药，比内吸型的草甘膦发挥作用速度更快，适用于对草甘膦产生抗性的地区，使用量也逐年增加。草甘膦在自然界和植物体内还会缓慢代谢，主要代谢产物有氨甲基膦酸（Aminomethyl Phosphonic Acid，AMPA）。草甘膦和草铵膦虽然属于低毒性农药，但其残留问题仍可能对人体健康造成威胁[2]。我国《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）对茶叶中草甘膦和草铵膦残留进行了规定，限量分别为1 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1[3]。在实际检验工作中，茶叶中草甘膦、草铵膦残留超标情况较为常见。

草甘膦、草铵膦以及代谢物氨甲基膦酸的极性均较强，微溶于有机溶剂，易溶于水，同时缺少荧光官能团，鉴于这些特性，目前实际检测中最常用的检测方法为液相色谱-串联质谱法，但现有液质联用法的提取净化过程复杂、试剂消耗量大、衍生时间较长，特别是离子交换柱洗脱过程对人员操作要求较高，人员误差较大[4-5]。笔者通过对提取净化方式、衍生条件、LC-MS/MS 色谱系统等进行优化，建立了一种同时检测草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸3 种物质的超高效液相色谱-串联质谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），过程简便、检测速度快、结果稳定，能满足日常茶叶中3 种物质的检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters I-Class/Xevo-TQD 超高效液相色谱串联质谱仪（Waters Corporation）；SE402F2H 电子天平（常州奥豪斯仪器公司）；控制型试管研磨机（艾卡广州仪器设备公司）；KS-3200E 超声清洗机（昆山洁力美超声仪器公司）；Velocity 18R 高速冷冻离心机（Dynamica Pty Ltd）；D14UV 明澈超纯水机（Merck Millipore Corporation）。

1.2 材料与试剂

标准品：水中草甘膦标准溶液、水中草铵膦标准溶液、水中氨甲基膦酸标准溶液、草甘膦同位素内标（水中1,2-13C215N 草甘膦），100 μg·mL-1，天津阿尔塔科技公司；甲酸、二氯甲烷、乙酸铵（上海阿拉丁生化科技公司，色谱纯）；乙腈（赛默飞公司，色谱纯）；芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl，上海阿拉丁生化科技公司，色谱纯）；硼酸钠（国药集团，分析纯）；CNWBOND HC-C18SPE 小柱（上海安谱）。

1.3 溶液配制

标准储备液：分别准确移取草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸标准品各0.5 mL 至10 mL 容量瓶，用一级超纯水定容，混匀，配制成5.0 μg·mL-1储备液，5 ℃下保存待用。

同位素内标1,2-13C215N 草甘膦溶液：用超纯水稀释内标标准溶液至1.0 μg·mL-1，5 ℃下保存待用。

系列标准工作溶液：准确移取草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸标准储备液各2 mL，混匀稀释成1 μg·mL-1的混合标准工作液。移取混合标准溶液100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL、5 000 μL 至10 mL 容量瓶，加入100 μL 1.0 μg·mL-1内标溶液，超纯水定容，得到浓度为10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1的系列标准工作溶液，其中内标浓度为10 ng·mL-1，现配现用。

30 g·L-1芴甲氧羰酰氯丙酮溶液：称取0.3 g 芴甲氧羰酰氯，用丙酮溶解并定容至10 mL。

1.4 样品前处理

称取粉碎茶叶试样1 g（精确至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入300 μL 1.0 μg·mL-1内标溶液，加入超纯水15 mL，浸泡30 min，再加入二氯甲烷10 mL，振荡20 min，4 000 r·min-1离心10 min。上层水溶液转移至另一离心管，再向残渣离心管中加入超纯水15 mL 复提一次，合并两次水溶液，混合充分。C18SPE 小柱经乙腈、水依次活化后，先加入1.0 mL 提取液过柱弃去滤液，再加入4.0 mL 提取液过柱，收集滤液。取净化后样液1.0 mL 加入5%硼酸盐缓冲溶液200 μL、30 g·L-1芴甲氧羰酰氯丙酮溶液200 μL，混匀，30 ℃下避光衍生6 h。衍生后溶液过0.45 μm 水相滤膜后，进行UPLC-MS/MS测定。混合标准工作液与样品同样方法进行衍生操作。

1.5 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A：含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸铵溶液；流动相B：含0.1%甲酸的乙腈；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流动相洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱程序

（2）质谱条件。离子源：ESI 电喷雾离子源，正离子扫描；脱溶剂气温度：450 ℃；脱溶剂气流速：1 000 L·Hr-1；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：3.2 kV；扫描方式：MRM 多反应监测；离子对信息见表2。

表2 草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸质谱离子对信息

2 结果与分析

2.1 提取与净化方式的选择

2.1.1 提取溶剂选择

草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸的极性均较强，难溶于正己烷、甲苯、二氯甲烷等有机溶剂，易溶于水，通过比较乙腈水、甲醇水、超纯水3 种提取溶剂，发现超纯水提取效率最高，同时加入二氯甲烷除去提取液中色素等脂溶性杂质[6-7]。

2.1.2 净化材料选择

在提取液净化方面，现有行业标准一般选用CAX 阳离子交换柱进行净化，但此方法需要调节提取液pH 值，试剂消耗大，且操作较烦琐。由于草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸的极性均较强，本文尝试选择C18、GCB、HLB、NH24 种反相固相萃取柱，采用保留干扰物方式对提取液进行净化，发现使用C18SPE 小柱净化，回收率较高且成本较低，故选择C18SPE 固相萃取柱作为本方法的净化柱。

2.2 衍生条件与时间的优化

2.2.1 衍生试剂浓度选择

配制浓度为1 ～50 g·L-1的芴甲氧羰酰氯Fmoc-Cl 作为衍生试剂，分别进行衍生试验，比较衍生效果。随着衍生试剂浓度的不断增大，衍生物响应增强，峰形更加对称、尖锐，但过量的衍生化试剂会产生大量沉淀，影响通过滤膜的速度，也容易污染仪器。因此，本文选择30 g·L-1Fmoc-Cl 作为衍生试剂[8]。

2.2.2 衍生时间优化

在选定的衍生条件下，进行不同衍生反应时长的试验，结果表明不同衍生时间（2 ～12 h）对草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸的衍生效果有较明显的影响，衍生物回收率随着衍生反应时间的延长而提高，当衍生反应时间达到6 h 后，继续延长衍生时间效果不明显。综合考虑实验效率，将衍生时间确定为6 h。

2.3 色谱柱的选择

衍生反应后，Fmoc-基团被引入草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸分子，C18色谱柱对其有较好的保留能力[9-10]。本实验分别使用ACQUITY UPLC® HSS T3柱（ 50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC®BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Kinetex®C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ZORBAX Eclipse Plus C18柱（ 50 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 种型号色谱柱进行茶叶中草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸分离效果的测试。结果发现使用ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱所得峰形的对称性和集中性最好，分析原因可能是该色谱柱使用BEH 亚乙基桥杂化颗粒技术，与常规的硅胶基质颗粒相比，能够控制硅醇活性以获得更好的响应、峰形和柱效。而使用其他色谱柱拖尾现象较严重、分离效果不理想。因此，选择ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱作为液相色谱系统分离柱。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法线性、测定低限

配制系列混合标准工作液（10 ～500 ng·mL-1）与样品同样方法进行衍生操作，使用相同的仪器条件进行测试，分别进样，内标法定量，绘制标准工作曲线，线性方程及相关系数见表3。3 种化合物在10 ～500 ng·mL-1线性关系良好，相关系数R2均大于0.995。利用仪器信噪比S/N=3 时的进样浓度，计算得到草甘膦、草铵膦及氨甲基膦酸3 种化合物的测定低限均为50 μg·kg-1。

表3 线性方程及相关系数

2.4.2 回收率、精密度

选取不同空白茶叶基质（绿茶、黄茶、红茶、花茶），添加不同浓度的草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸混合标准溶液，添加水平为0.05 mg·kg-1（加标1）、0.10 mg·kg-1（加标2）、1.00 mg·kg-1（加标3），按照上述实验方法，平行测定6 次，并做空白对照。草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸的回收率和相对标准偏差结果见表4。结果显示，草甘膦的平均回收率为80.8%～94.3%，相对标准偏差（n=6）为2.6%～7.1%；草铵膦的平均回收率为82.0%～95.1%，相对标准偏差（n=6）为2.4%～7.3%；氨甲基膦酸的平均回收率为83.1%～95.5%，相对标准偏差（n=6）为1.9%～8.2%。表明实验回收率满足检测要求、重复性较好。

表4 方法的回收率和精密度（n=6）

2.4.3 实际样品检测

使用本方法对市售茶叶进行检测，包括绿茶20 组、黄茶15 组、红茶5 组、花茶5 组。其中绿茶草甘膦检出2 组、黄茶草甘膦检出1 组，但未超出限量值（GB 2763—2021 规定茶叶中草甘膦限量为1 mg·kg-1），其余均未检出。

3 结论

本实验建立了采用UPLC-MS/MS 测定茶叶中草甘膦、草铵膦、氨甲基膦酸农药残留的方法，从提取与净化方式、衍生条件、色谱柱等方面进行优化调整，最终选用纯水作为提取溶剂，并用二氯甲烷除去部分脂溶性杂质，经C18SPE 小柱吸附净化后，在5%硼酸盐缓冲环境下与芴甲氧羰酰氯Fmoc-Cl 衍生反应，生成利于液质联用仪检测的衍生物。本方法操作简便、试剂消耗量少，有利于控制人员操作误差、提高检测效率。利用本方法对市售茶叶及代用茶样品进行检测，结果表明该方法定量准确、回收率重复性好，可用于茶叶中草甘膦等农药残留的日常检测。