食品中霉菌和酵母计数的不确定度评定

魏 敏，姜华军，王言爽，程 丞

（威海市食品药品检验检测研究院，山东威海 264210）

霉菌和酵母菌都属于真菌类，在自然界中广泛分布。当食品受到霉菌和酵母菌污染时，易发生霉坏变质。很多种类的霉菌能够产生有毒的代谢产物，从而引起急性或慢性中毒，特别是黄曲霉毒素等真菌毒素具有很强的致癌性[1]。在食品微生物学中，霉菌和酵母计数是重要的指示菌指标，可用于评价食品的被污染程度，在乳制品、饮料、糕点等多个产品类别的食品安全国家标准中都制定有霉菌或霉菌和酵母菌总数的限量要求[2-5]。为进一步加强本实验室的质量管理，评价本实验室的检测能力，本实验室参加了面粉中霉菌和酵母菌计数检验能力验证，并进行测量不确定度的评定，以进一步提高霉菌和酵母计数检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠，天津市致远化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，北京路桥技术股份有限公司；面粉中霉菌和酵母菌计数能力验证样品，中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器与设备

电 子 天 平（XPR1202S）， 瑞 士METTLER TOLEDO 公司；拍击式均质器（Bagmixer 400SW），法国Interscience 公司；霉菌培养箱（MI-250A），美国STIK 公司；生物安全柜（AB2-4S1），新加坡ESCO 公司；立式压力蒸汽灭菌器（HVE-50），日本Hirayama 公司。

1.3 实验方法

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）第一法霉菌和酵母平板计数法进行能力验证样品的检测[6]。

量取225 mL 无菌生理盐水置于均质袋中，在生物安全柜内打开能力验证样品的西林瓶，将样品加入均质袋，同时加入25 g 对应的面粉基质，拍击均质1 min，得到1 ∶10 样品匀液。吸取1 mL 1 ∶10样品匀液，注于9 mL 无菌生理盐水中，混匀制成1 ∶100 样品匀液。按上述步骤，依次进行10 倍系列稀释。选择2 个适宜稀释度，从每个稀释度的样品匀液中分别吸取1 mL 加入2 个无菌培养皿，空白对照为吸取1 mL 无菌生理盐水加入2 个无菌培养皿。将融化的马铃薯葡萄糖琼脂培养基冷却至46 ℃，立即倾注约25 mL 于每个培养皿中，混合均匀。琼脂凝固后将平板正置，放入28 ℃霉菌培养箱中培养5 d，观察并报告检测结果。

2 结果与分析

2.1 建立数学模型

待测样品中霉菌和酵母菌总数的计算公式为

则样品制备引入的相对标准不确定度为

式中：T为待测样品中霉菌和酵母菌总数，CFU·g-1；C为某一稀释度的1 个平板中霉菌和酵母的菌落数之和，CFU；V为样品匀液加样体积，mL；d为稀释因子，g·mL-1。

2.2 不确定度分量的来源分析

霉菌和酵母计数的不确定度来源主要有样品制备urel(P)、样品稀释urel(D)、加样过程urel(S)和重复性测量urel(R)。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1 样品制备引入的相对标准不确定度urel(P)

本实验称取25.00 g 能力验证面粉样品，加入到225 mL 无菌生理盐水中，不确定度主要来源于称量面粉样品时电子天平引入的不确定度和量取无菌生理盐水稀释液时量筒引入的不确定度。

所用电子天平感量为0.01 g，根据《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008）[7]，其最大允许误差为±0.05 g，按均匀分布，

2.3.2 样品稀释引入的不确定度urel(D)

本实验依次吸取1 mL 不同稀释度的样品匀液加入9 mL 无菌生理盐水中进行10 倍系列稀释，吸取样品匀液和生理盐水分别用到1 mL 和10 mL 吸量管，因此不确定度主要来源于移取液体时吸量管引入的不确定度。根据JJG 196—2006[8]，1 mL 和10 mL 吸量管的容量允差分别为±0.008 mL 和±0.05 mL，按均匀分布，其标准不确定度分别为

则样品稀释时1 mL 和10 mL 吸量管引入的相对标准不确定度分别为

每稀释一次需分别使用一次1 mL 和10 mL 吸量管，本实验采用1 ∶100 稀释度的平板进行霉菌和酵母计数，即只进行了一次稀释。样品稀释引入的相对标准不确定度为，则称量样品时电子天平引入的标准不确定度为

称量样品时电子天平引入的相对标准不确定度为

2.3.3 加样过程引入的不确定度urel(S)

本实验加样过程是用1 mL 吸量管分别吸取1 mL 样品匀液加入2 个培养皿中，1 mL 吸量管引入的不确定度计算方法同2.3.2。加样过程引入的相对标准不确定度为

所用量筒容量为250 mL，根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[8]，其容量允差为±2.0 mL，按均匀分布，，则量取稀释液时量筒引入的标准不确定度为

量取稀释液时量筒引入的相对标准不确定度为

2.3.4 重复性测量引入的不确定度urel(R)

在相同的实验条件下，由同一名检验人员对能力验证样品中的霉菌和酵母总数重复检测20 次，20 次检测结果的平均值以X—表示，结果见表1。由于检测结果有很大的发散性，若直接计算样本标准差，所得到的不确定度很大。本研究将重复检测的结果均转换为以10 为底的对数值后再进行不确定度的计算[9-11]。

表1 能力验证样品中霉菌和酵母计数重复检测结果

用贝塞尔公式计算标准差，得到样品重复性测量引入的相对标准不确定度为

2.4 相对合成标准不确定度

根据以上各不确定分量的评定结果进行不确定度的合成，霉菌和酵母计数的相对合成标准不确定度为

[6] 国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品微生物学检验 霉菌和酵母计数:GB 4789.15—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.

[7] 国家质量监督检验检疫总局.电子天平检定规+0程 规u5r2 程e:6 l J(3JDG:2

[ J8+)J] 1G+00国.3u1069r2家e0—l66(— 质S25)023量+002 80u+监[6r2Se0[l S] 督(.. 0R] 北.1检)北2京 验7京0:检2 中:=中疫0国.国0总质1计6局检 量2出.3常 出版版用社社玻,2璃,02 00量80.6器.检定

[9] 赵玲,王邱,王冰,等.饮料中霉菌和酵母计数检验结果的不确定度评估[J].食品安全质量检测学报,2016,7(12):4749-4752.

2.5 扩展不确定度

根据JJF 1059.1—2012[12]，取置信概率p=95%，自由度ν=19，查询t分布表得到包含因子k=2.09，扩展不确定度为

2.6 结果报告

样品中霉菌和酵母计数检测结果的对数值为lgX=3.668 4±0.033 9，取反对数之后得到霉菌和酵母计数检测结果为4 310 ～5 038 CFU·g-1，修约后为4 300 ～5 000 CFU·g-1。

3 结论

本研究按照GB 4789.15—2016 进行面粉中霉菌和酵母计数能力验证样品的检测，并对测量不确定度进行评定。不确定度主要来源于样品制备、样品稀释、加样过程和重复性测量。从评定结果来看，对霉菌和酵母计数不确定度贡献最大的是样品重复性测量引入的不确定度。重复性测量引入的不确定度属于A 类不确定度，受检测人员、实验环境、样品均匀性等因素的影响。实验室可从多方面加强质量控制，降低不确定度，确保检测结果准确、可靠。