糕点中脱氢乙酸检测方法的改进

时间：2024-05-14

王俊杰

（河南中测技术检测服务有限公司，河南郑州 450000）

脱氢乙酸对霉菌、酵母菌等微生物的抑菌能力极强，是一种高效、广谱、低毒的防腐剂，广泛用于面包、糕点、果蔬汁、肉制品和酱腌菜等食品[1-4]。脱氢乙酸需要添加较高的剂量才能起效，如0.1%浓度可以有效抑制霉菌，0.4%浓度可以有效抑制细菌，因此很多从业者出于防腐效果的考虑，往往会超限量使用[5-10]。毒理学研究表明，脱氢乙酸会对人体的肾脏、肝脏以及中枢神经系统产生慢性毒性，并可能引发癌症[11-16]。根据《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[17]，我国目前规定糕点中的脱氢乙酸限量为0.5 g·kg-1，腌渍蔬菜、淀粉制品限量为1.0 g·kg-1，面包、果汁、肉制品、调料等其他产品的最大使用量不得超过0.3 ～0.5 g·kg-1。

《食品安全国家标准食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[18]规定了脱氢乙酸的液相色谱和气相色谱检测方法，其中应用最广泛的是液相色谱检测方法。本文在此标准的基础上，改进了前处理方法，得到了更高的精度和加标回收率，为测定糕点中的脱氢乙酸提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：饼干（指定值0.645 g·kg-1），大连中食国实检测技术有限公司；脱氢乙酸标准储备液（CAS 号：A22080082；ρ=2 000 μg·mL-1），坛墨质检科技股份有限公司；乙酸铵（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），美国默克公司；无水乙醇（分析纯），天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters 液相色谱仪，美国Waters 公司；二极管列阵检测器，美国Waters 公司；XB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），中国月旭科技（上海）股份有限公司；优普纯水机，美国Millipore 公司；电子天平，上海科创色谱科技有限公司；水浴锅；超声清洗仪；pH 试纸。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂配制

乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）：称取1.54 g 乙酸铵，溶于水并稀释定容至1 L；氢氧化钠溶液（20 g·L-1）：称取2 g 氢氧化钠，溶于水并稀释定容至100 mL。

1.3.2 标准溶液的配制

脱氢乙酸标准工作液：分别吸取脱氢乙酸标准储备液10.0 μL、25.0 μL、50.0 μL、75.0 μL、100.0 μL、125.0 μL 和150.0 μL，置于1 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，得到浓度分别为20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、150 μg·mL-1、200 μg·mL-1、250 μg·mL-1和300 μg·mL-1的系列标准溶液。

1.3.3 样品处理

精确称取2 g 样品（精确至0.001 g），置于25 mL离心管中，依次加入约10 mL 纯水，5 mL 无水乙醇，涡旋摇匀，用氢氧化钠溶液（20 g·L-1）调节pH 至8.0，加无水乙醇稀释定容至25 mL，再次摇匀。超声提取30 min，转移至离心管中，10 000 r·min-1离心3 min，取上清液过0.22 μm 有机滤膜后上机测定。1.3.4 测定

以色谱峰的保留时间定性，确定脱氢乙酸的色谱峰，再根据峰面积外标法定量测得脱氢乙酸的具体含量。具体过程：将标准溶液和测定溶液注入液相色谱仪，分别测得相应的峰面积，以标准工作溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线得到测定溶液中的脱氢乙酸浓度。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙酸铵+甲醇＝95+5（V/V）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：293 nm；waters 2695/waters 2996 二极管列阵检测器。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

按照GB 5009.121—2016 标准中的方法，对面包、糕点类样品进行前处理时，分别加入硫酸锌和氢氧化钠等试剂、调节pH、超声萃取后，需要用正己烷分层萃取，在这个过程中，由于步骤比较烦琐，容易出现样品中脱氢乙酸提取不充分、分层不清晰等情况，造成准确度和加标回收率不高，常低于80%。用改进后的方法，由于脱氢乙酸易溶于无水乙醇及氢氧化钠溶液，提取比较充分，提高了结果的准确性及加标回收率，且此方法不用萃取分层，步骤简单，对比结果见表1。

表1 两种不同前处理脱氢乙酸的加标回收率

2.2 方法的准确性

称取约2 g 标准品，按1.3.3 方法处理，测定峰面积，并计算回收率，检测结果见表2。表2 数据表明，回收率符合实验室质量控制相关标准[19-20]要求。

表2 两种不同前处理脱氢乙酸的准确度

2.3 称样质量的确定

实验过程发现，改进方法的称样量对结果的准确度和加标回收率有较大影响，通过称取1 g、2 g和5 g 样品对比发现，称取约2 g 的结果最接近真值（0.645 g·kg-1），准确度最高。对比结果见表3。

表3 3 种不同称样质量测得脱氢乙酸的准确度

2.4 方法的重复性

在空白糕点中加入脱氢乙酸标准溶液制得浓度为0.250 g·kg-1的模拟样品，按上述方法处理，重复进样6 次，测定含量，计算相对标准偏差，结果见表4。经测定和计算，进样6 次的RSD 为0.87%，说明方法的重复性较好。

表4 改进方法前处理模拟样品含量

2.5 标准曲线与检出限

取脱氢乙酸的标准工作液分别进样，进样体积为10 μL，测定峰面积。以浓度（μg·mL-1）为横坐标、峰面积(μv·S-1)为纵坐标，进行回归分析。通过测定和计算，浓度、峰面积的线性回归方程为y=30 280x-58 508，相关系数为0.999 8。采用溶液稀释法，不断稀释脱氢乙酸标准溶液，在不改变色谱条件的情况下进行测定，按样品取样量为2 g，检出限为0.001 5 g·kg-1，该结果低于现行国标方法的检出限[21]。