探究复配蓝莓提取物叶黄素制剂的急性及长期毒性

王玉莹，甘 露，王荣昌

（江苏天美健大自然生物工程有限公司，江苏 南京 210046）

蓝莓又名笃斯越橘（Vaccnium uliginosum），属杜鹃花科（Ericaceae）、越橘属（Vaccinium）植物，其果实中含有花青素及黄酮等多种活性成分[1]。花青素又称花色素，多以糖苷的形式存在，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物[2]。研究表明，蓝莓花青素具有多种保健功能，在动物体内、体外实验显示具有抗肿瘤作用，它的抗氧化作用高于等浓度的抗坏血酸，在治疗和预防眼病如缓解视疲劳、白内障、青光眼和视网膜病变等方面显示了很好的应用前景[3-7]。通常使用传统的溶剂萃取法提取花青素，这是因为花青素主要以花青素糖苷的形式存在于大自然中，且具有较强的极性[8-9]。提取时，通常使用亲水性有机溶剂，如甲醇、乙醇等，以及亲脂性有机溶剂，如石油醚、乙酸乙酯等。不同的提取方法会造成一定的溶剂残留，以致会影响到产品的安全性，它们作为保健食品的生产原料，需对产品进行安全性评价。本文以从蓝莓鲜果提取物的花青素为原料，配伍叶黄素制备成蓝莓提取物叶黄素制剂，通过急性毒性试验和30 d 喂养试验来评价复配蓝莓提取物叶黄素制剂的安全性，旨在为蓝莓提取物类保健食品的开发利用提供安全性实验依据。

1 材料与方法

1.1 样品

试样由某生物工程有限公司提供，规格0.5 g/粒，服用量2 粒/日，花青素及叶黄素含量分别为3%、1.2%。该产品的人体推荐量为16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 计）。

1.2 主要仪器设备

TD12001 型电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司。

1.3 试验方法

本实验采用《保健食品检验与评价技术规范》（2003 版）中小鼠急性经口毒性实验中的最大剂量耐受法，设试样20 g·（kg bw）-1一个剂量组。共20 只动物，雌性10 只、雄性10 只，经口灌胃给样，取浓度为0.5 g·mL-1的试样液两次给予试样，两次给样间隔5 h，给样剂量相当于20 g·（kg bw）-1。给试样14 d 之后，观察动物的基本状况、体重变化、死亡情况和中毒症状。

参照《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）进行大鼠30 d 喂养试验。实验选取80 只SD 大鼠，按性别、体重随机分4 组（每组20 只，雌、雄各半），即低剂量组0.42 g·（kg bw）-1、中剂量组 0.83 g·（kg bw）-1和高剂量组1.67 g·（kg bw）-1和一个空白对照组（大豆油）。低、中、高3 个剂量组的剂量分别相当于人体推荐量16.67 mg·（kg bw·d）-1（人以60 kg 计）的25 倍、50 倍和100 倍。采用灌胃给予受试物，按5 mL·（kg bw）-1经口灌胃给予低、中、高剂量组各浓度试样和大豆油，连续灌胃30 d。实验过程中，大鼠均单笼饲养，饮水、进食自由。每周记录进食量、体重，计算食物利用率，末次给试样后禁食16 h 后称空腹体重，对每只大鼠腹主动脉取血并进行血液学和血液生化指标检查，之后对每只大鼠进行脏器解剖观察，同时取肝脏、肾脏、脾脏和卵巢（睾丸）称重并计算脏体比；取肝脏、肾脏、脾脏和卵巢（睾丸）等组织，经固定、石蜡切片、H-E 染色和光镜观察等进行病理组织学检查。

试验数据以平均值（x）±标准差（s）表示，即x±s。方差分析与统计学检验采用孙瑞元等编辑的DAS 统计软件中的多组均数分析方法，即先对试验数据进行方差齐性检验，如果方差齐，就采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异后再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数进行两两比较；如果方差不齐，则改用秩和检验统计。

2 结果与分析

2.1 大鼠、小鼠的急性经口毒性试验

给予试样后，14 d 内未见试验大鼠、小鼠出现死亡情况和中毒症状，体重均增加，该试样雌、雄性大鼠、小鼠经口毒性最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1（表1）。表明蓝莓提取物叶黄素制剂试样为无毒。

表1 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠、小鼠急性经口毒性的试验结果（x±s）

2.2 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠体重的影响

由图1 可知，试验期间，随时间的增加，雌、雄大鼠的体重逐渐增加，试样的低、中、高剂量组中大鼠体重和对照组相比，p＞0.05，即差异均无显著性意义。试验结果表明，蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠体重无明显影响。

图1 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠体重的影响 （x±s，n=10）

2.3 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠进食量、食物利用率的影响

由图2 可知，给予雌性、雄性大鼠30 d 不同剂量受试物，雌性、雄性大鼠的体重和摄食量呈正相关，和食物利用率呈负相关。试验动物高、中、低剂量组的不同性别大鼠体重、体重增加、进食量和食物利用率与对照组相比，p＞0.05，均无统计学差异。各时间点的高、中、低剂量组大鼠周进食量、体重增加和总进食量及总食物利用率、周食物利用率和对照组比，p＞0.05，差异均无显著性意义。试验结果表明，蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠周进食量、总食物利用率、周食物利用率均无显著影响。

图2 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠周进食量、体重增加和总进食量及食物利用率的影响（x±s，n=10）

2.4 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血常规各项指标的影响

大鼠喂养试验30 d 后的血液指标结果显示，高、中、低剂量组雌、雄大鼠的血常规各项指标，即白细胞、血红蛋白、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，与对照组相比，p＞0.05，差异均无显著性意义（图3）。试验结果说明，蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血常规各项指标无明显影响。

图3 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血常规各项指标的影响图（x±s）

2.5 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血液生化指标的影响

蓝莓提取物叶黄素制剂高、中、低3 个剂量组的雌性、雄性大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、总胆固醇、甘油三酯、血糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白和白/球等11 项指标与对照组比较，p＞0.05，差异均无显著性意义（图4）。试验结果表明，蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血液生化指标无明显影响。

图4 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠血生化的影响

2.6 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠脏器重量和脏体比的影响

蓝莓提取物叶黄素制剂高、中、低3 个剂量组大鼠肝脏、脾脏、肾脏、性腺（睾丸/卵巢）的脏器重量和脏体比，与对照组相比，p＞0.05，差异均无显著性意义。雌性大鼠中剂量组卵巢重较对照组低（p＜0.05），但未超出实验室历史对照范围，也无剂量依赖性，故无生物学意义（图5）。试验结果表明，蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠脏器重量和脏体比也不产生明显影响。

图5 蓝莓提取物叶黄素制剂对大鼠脏器重量和脏体比的影响（x±s）

2.7 大鼠病理组织学检查

通过镜下病理组织检查发现，高剂量组和对照组大鼠肝脏、肾脏、脾脏和胃肠组织学结构均正常，均未出现增生、脱落、肥大、坏死、萎缩、出血或水肿等现象。高剂量组和对照组大鼠的卵巢、睾丸组织学结构正常，可见正常发育的卵泡、生精细胞，间质未见异常。在中、低剂量组的以上几种组织的组织病理学镜下观察中也均未见异常 现象。

3 结论

蓝莓提取物叶黄素制剂的急性毒性试验中，雌雄两性大、小鼠经口最大耐受量均大于 20 g·（kg bw）-1，根据急性毒性（LD50）剂量分级标 准，蓝莓提取物叶黄素制剂属无毒级；在大鼠30 d喂养试验中，蓝莓提取物叶黄素制剂的低、中、高3 个剂量组中的大鼠体重、进食量和食物利用率、大鼠血细胞和血液生化指标、大鼠脏器重和脏体比及组织病理学检查的各项参数与对照组的这些参数相比无异常，未见有毒性反应。蓝莓提取物叶黄素制剂的急性毒性试验及30 d 喂养试验结果表明，蓝莓提取物叶黄素制剂作为保健食品，其食用性是无毒和安全的。