食源性致病菌快检技术研究进展及应用现状分析

张士财，丁卫平

（滨州市检验检测中心，山东 滨州 256603）

食源性致病菌依然是引起人类食源性疾病的主要原因[1]。根据世界卫生组织2021年的报告，每年约有6 亿食源性疾病病例，即使是一些发达国家，如美国，每年也有1/4 的人罹患食源性疾病[2-3]。近几年，我国不断加大食品安全抽检力度，由国家市场监督管理总局公布的食品安全监督抽检结果数据可以看出微生物超标占检测不合格项目的比例呈逐年下降趋势（2019年占比28.4%，2020年占比23.03%，2021年占比22.40%）[4-5]，但仍然占较高比例，是威胁食品安全的主要因素之一。随着我国对食品安全重视程度的提升以及科学技术的发展，食源性致病菌快速检测（以下简称快检）技术迅猛发展，以免疫标记技术、核酸扩增技术、生物传感器技术等为基础的快检技术成为食源性致病菌检测的主流，每种技术原理不同，但相较于传统技术，因具有高效、快速、特异的优势而成为研究热点。

1 免疫标记技术

免疫标记技术指利用免疫分子抗原和抗体特异结合的原理，并用荧光素、酶、胶体金等标记物对免疫分子进行标记，通过检测标记物相关信号指标，以实现对特定抗原抗体的定性或定量检测。

1.1 免疫酶技术

免疫酶技术即以酶作为标记物，待测组分与相应的抗原或抗体作用后，酶得以催化底物而发生颜色反应，通过颜色变化而对待测物作定性和定量分析[6]。应用最广的是酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA），其抗原抗体特异性结合反应在固相载体上进行，实验步骤和操作过程更加简便。ELISA 又包括双抗体夹心法、间接法、竞争法、生物素-亲和素法。向双林等[7]利用杂交瘤技术制备了高纯度的单克隆抗体6A6、2A2，并建立了具有良好敏感性的双抗夹心ELISA 检测方法检测阪崎肠杆菌，其检测限达1.0×103CFU·mL-1，与其他数种食源性致病菌无交叉效应。

1.2 免疫荧光技术

免疫荧光技术即以荧光素作为标记物，与特异抗体或抗原结合后产生荧光，通过荧光显微镜监测荧光反应来检测目标致病菌的一种方法。目前研究较多的荧光素有免疫荧光微球和量子点。梁珊[8]利用免疫磁珠技术和免疫荧光技术相结合的方式，对痕量的李斯特菌进行特异性检测，将具有长波荧光发射的CdZnTe 量子点标记检测抗体作为特异性信号指示剂，其检测方法具有1 ～109CFU·mL-1的宽检测范围和1 CFU·mL-1的低检测限，实现了对李斯特菌异常灵敏的检测。

1.3 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术在食源性致病菌检测中应用最多的是胶体金免疫层析技术，是以胶体金作为标记物标记抗体，将需要的抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜（NC 膜）上，待测样品添加到样本垫上，通过层析作用在NC 膜上向一侧迁移，待检物先与金标抗体形成结合物，再迁移至固定的抗原或抗体的区域，发生特异性结合而聚集并显示出胶体金的橘红色或紫红色，肉眼观察即可判断待测组分的有无[9]。山珊等[10]首先用免疫磁珠对目标菌进行富集，再利用胶体金标记抗体并同时偶联β-内酰胺酶，当目标菌存在时，β-内酰胺酶高效地水解青霉素，再将水解液滴加到免疫层析纸条上，通过间接检测青霉素而使转导信号放大，从而实现了对大肠杆菌O157 ∶H7的特异性检测，最低检出限为2×102CFU·mL-1，极大提高了此方法的检测灵敏度。

免疫标记技术基于免疫分子抗原抗体特异性结合的原理，提高了致病菌检测的特异性，但也有一定局限性，如酶标记物需要有一定的纯度和活度，荧光标记物则需要较高的荧光效率。此方法整个过程步骤较多，受固相载体、抗原、受检样品、洗涤剂、稀释剂、作用时间以及检测仪器等因素影响，往往导致结果偏差。同时，抗原抗体高度特异性结合，而食源性致病菌种类繁多，往往一个检测试剂盒只能检测一种抗原，也造成了检测通量低的问题。

2 核酸扩增技术

核酸扩增技术以核酸为基础，在酶的作用下通过变性、退火、延伸重复循环过程实现核酸的体外复制扩增，进而达到检测目标致病菌DNA 或RNA 的目的[11]。近几十年，在普通聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）基础上衍生出多种技术，用于食源性致病菌检测的方法主要有多重聚合酶链式反应、荧光定量聚合酶链反应、数字聚合酶链反应以及等温扩增技术。

2.1 多重聚合酶链式反应

多重PCR 是在普通PCR 基础上，在一个反应体系内加入多种特异性引物而同时对多个模板进行扩增的方法。其能够进行多种致病菌检测，提高了检测通量，缩短了检测时间[12]。张明娟等[13]通过优化引物设计、反应体系、反应条件建立了一个在PCR反应体系中同时检测单增细胞增生李斯特菌等10 种食源性致病菌的多重PCR 检测方法，在人工污染样品评价中，结果显示出此体系特异性强，灵敏度高，10 种致病菌检出限均可达10 CFU·mL-1。

2.2 荧光定量聚合酶链式反应

荧光定量PCR 是在PCR 反应体系中加入荧光标记的探针（常用TaqMan 探针）或者荧光染料（常用SYBR Green 染料），通过仪器来监测PCR 反应过程中荧光信号的积累，最后分析CT 值或者建立标准曲线来实现对待测成分定性定量分析的技术。董瑞等[14]以金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌为测试对象，设计特异引物和探针，并与GB 4789 系列标准方法进行比较，检测结果与国标一致，并能大大缩短检测时间。

2.3 数字聚合酶链式反应

数字PCR 是在荧光定量PCR 的基础上，将反应体系分布到芯片微孔中实现微滴化，理想状态下每个微孔中最多只有一个核酸拷贝，通过仪器对荧光信号进行泊松分布统计分析，进而实现对初始样本中核酸拷贝的含量测定。张明明等[15]在单重数字PCR 基础上建立了检测伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单核细胞增生李斯特氏菌的三重数字PCR体系，结果显示线性相关性和重复性较好，最低检 出 限 分 别 为0.23 copies·µL-1、0.18 copies·µL-1、 0.42 copies·µL-1。

2.4 等温扩增技术

等温扩增技术即在同一恒定温度下，对靶序列进行特异性扩增，使其产生大量拷贝以达到检测水平的体外扩增技术。食源性致病菌常用的等温扩增技术主要有环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、 重 组 酶 介 导核 酸 扩 增 技 术（Recombinase Aided Amplification，RAA）、重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等。

LAMP 是指在60 ～65 ℃的恒定温度，链置换DNA 聚合酶作用下，使用4 种不同的引物来扩增靶基因上的6个不同区域，进行体外核酸扩增的技术[16]。XU 等[17]开发了一种简单、灵敏、特异性和可视化LAMP 方法来检测霍乱弧菌毒力相关和物种特异性基因，在可见光下发生颜色变化（从橙色到浅绿色），通过肉眼即可读取阳性结果，可用于快速筛选各种来源的水和常用的鱼类样本中的霍乱弧菌。RAA 与RPA 原理相似，皆是在等温条件下（最适温度37 ℃）通过重组酶、重组酶加载因子和单链结合蛋白与引物和靶序列的相互作用，完成核酸靶序列的体外扩增的技术，不同点是两者重组酶来源不同[18-20]。姚丽锋等[21]建立了铜绿假单胞菌lasB 基因RAA 检测方法，人工污染实验评价特异性良好，对其他致病菌无交叉反应，检测时间仅需20 min，对纯菌液的检测灵敏度达到了1.7 pg·μL-1。

核酸扩增技术以其高灵敏度，高特异性等优势，被广泛应用于食源性致病菌检测[22]。多重PCR 能够实现几种甚至十几种致病菌同时检测，相比于荧光定量PCR，多重PCR 不需要合成价格较贵的探针，所需仪器及试剂费用较低，但是其局限在需要设计多对特异性引物以防止同一体系出现非特异性扩增，同时需要结合下游的凝胶电泳成像技术才能得到检测结果。荧光定量PCR 相较于多重PCR 引入探针使扩增特异性更强，灵敏度更高，仪器监测荧光信号过程结束即可分析得到检测结果，更加便捷快速，可进行定性和相对定量分析，但由于荧光检测通道限制，很难实现高通量检测，而且探针合成和仪器费用较高，提高了检测成本，在检测样本低拷贝以及存在抑制剂时容易出现假阴性等现象。数字PCR 相较于荧光定量PCR，具有高灵敏度、高精确度、对抑制剂高耐受性和绝对定量等优点[23-24]，但与荧光定量PCR 类似具有试剂仪器费用成本高等局限。LAMP、RAA、RPA 等温扩增技术检测效率高，实用价值强，只需要在等温条件下，几十分钟即可实现产物大量扩增。由于其所需设备简单，环境条件要求低，非常适合在基层食品安全监测的应用，目前我国已经出台多个LAMP 检测行业标准[25-26]。LAMP 同样也存在着明显的缺点，其只适用于扩增较短片段，并且引物设计相较于传统PCR 方法难度大，因引物多、温度低导致其扩增产物组成较复杂，特异性难以验证，反应体系极易受到污染[27-28]。

核酸扩增技术在灵敏度、特异性、定量检测等方面较传统检测技术有无可比拟的优势，但其以致病菌核酸为检测对象，无法分辨死活细胞而出现假阳性，因此需要结合其他检测技术进行相互确证。

3 其他快检技术

除了基于免疫学原理和核酸扩增原理的快检技术外，在食源性致病菌检测中研究较多的还有生物传感器技术、质谱技术、生物芯片技术和光谱技术等。生物传感器是对生物分子（如酶、抗体、抗原、核酸等）进行设计或者修饰，使其能与待测物发生反应从而产生浓度信号，经过物理或化学等技术进行信号转换，最终输出为可供检测的电信号，再经过系统分析处理便可得到实验数据，在致病菌检测中应用最多的是电化学生物传感器和光化学生物传感器[29]。质谱技术在致病菌检测研究最多的是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱，其原理是基于不同致病菌带有不同的核糖体蛋白质，在与基质溶液反应后，在激光辐射下样品发生电离，经过飞行时间检测器，不同质荷比的离子分开，形成细菌特异性的质谱图，与已有数据库进行比对来确定细菌的种属[30]。生物芯片是将靶标基因的特异性序列作为探针固定在玻璃芯片、硅芯片或尼龙膜等载体上，然后与标记的待测靶标基因按碱基配对原理杂交，经放射自显影、激光共聚焦荧光检测或酶-底物显色系统等处理芯片，得到特定信号来判定是否存在目标菌[31]。光谱技术是基于物质与电磁辐射作用，物质内部发生量子化的能级跃迁而产生发射、吸收或散射辐射等现象，通过对特定波长和强度进行分析来检测待测物的一种技术，研究较多的如近红外光谱和表面增强拉曼光谱[32]。

4 快检技术在基层食源性致病菌监测中应用现状及建议

快检技术种类繁多，在基层的应用主要集中在食用农产品农药残留和兽药残留的监测领域，对于食源性致病菌的检测应用较少[33-34]。目前快检技术已有部分国家标准，并已有部分地区配备了基于LAMP 的快检仪器，但在食源性致病菌检测结果方面不尽人意[35]。大多数快检技术仍然处于实验室研究阶段，为加快快检技术基层落地发挥其优势，提升基层食品安全监测水平，提出以下几方面建议。

4.1 加快完善标准体系，为快检提供标准支撑

由于快检技术种类繁多，多种技术融合发展，尽管一些快检技术已有行业标准，但检验标准涉及面较小，同时快检技术所需试剂、仪器设备等缺少相应的计量和检定标准，大大影响了快检技术的准确性，应加快快检方法的标准认定，拓展检测范围，为快检技术基层落地提供法规依据。

4.2 加快产品研发，提高产品质量

成本投入高是限制快检技术在基层应用的重要因素之一。虽然快检技术多种多样，但大多数技术只是在高校、研究院及大型实验室进行，试剂耗材成本较高，仪器设备价格昂贵，如数字PCR 仪器、质谱仪等，基层生产企业、检测站等机构无法承担。目前虽有便携化快检仪器，但种类较少，试剂质量稳定性差，成本较高。因此，我国应加快快检商品化试剂和便携仪器的研发，提高产品质量，开拓快检市场。

4.3 加强人员培训，提高检测水平

当前快检仪器和试剂生产、研发和应用的专业人员不足，基层检测室检测人员往往是兼职从事检测工作，一些基层虽然配备了快检仪器，但是人员专业能力不强，出现检测问题无法解决，应加强基层专业技术人员培训，组织能力验证，提升基层人员检测水平。

4.4 建立快检一体化平台，实现数据共享

基层食品安全工作以及食品生产企业面临不少困难，很难在食品安全监测工作上加大投入。因此，可以加强市县两级联动，建立食源性致病菌监测一体化的快检平台，通过人员共享、仪器共享、数据共享等实现快检技术在基层落地。

5 结语

微生物污染在食品监督抽检不合格项目中占比较大，仍然需要加大对食品微生物指标的监测力度。近几年，以免疫学、分子生物学、蛋白质组学、光谱学以及质谱学等原理为基础的现代检测技术不断发展。相比传统技术，快检技术在特异性、灵敏度、检测效率等方面具有巨大优势，为食源性致病菌快检技术的发展和应用提供了机遇。当前，由于受微生物本身特点影响，原始样本中的菌体载量较低，需要培养富集是限制检测速度的关键因素，快检技术在缩短富集时间方面仍然需要进一步探索。免疫磁珠分离技术的应用减少了检测时间，但免疫磁珠富集利用抗原抗体特异结合原理，往往只对一种致病菌发挥作用，很难实现高通量操作，商品化试剂盒的种类较多，灵敏度稳定性方面良莠不齐[36-37]。虽然这些现代化技术或多或少都存在不足之处，如试验成本高、操作技术要求高、方法不成熟等问题，但随着多学科、多种技术结合等新技术的研发，快检技术必将朝着更高效、更灵敏、更准确以及更便捷的方向发展，为食品安全监管提供技术支撑。