微生物检测技术在食品检验中的运用

时间：2024-05-14

朱丽香，刘娜

（中国检验检疫科学研究院综合检测中心，北京 100124）

微生物导致的食品安全问题十分常见，对人们的健康造成了严重威胁，如由致病微生物导致腹泻等疾病，严重危害人们的身心健康。目前，食品安全问题已得到广泛重视，我国出台了诸多政策法规，并积极落实，严格控制食品中的微生物污染。对食品检验机构而言，微生物检测技术是一种常用的技术手段，能够有效检出食品中存在的有害微生物，为食品质量提供保障。因此，加强对微生物检测技术的研究具有重要的现实意义，对于提高食品检验质量具有重要作用。

1 微生物检测技术概述

1.1 定义

微生物检测技术是一种检出食品或其他产品中微生物的技术手段，是食品质量管控体系的主要组成部分，同时也是评估食品卫生质量的重要标准，并非单指一项技术，而是诸多技术类型的总称，用于检测有害微生物的技术均可称作微生物检测技术[1]。如今，随着对食品检测要求的不断提高，我国微生物检测的指标内容也在不断增加，具体包括霉菌、致病菌、菌落总数等。微生物检测应遵循“预防为主”的原则，严加防控微生物引发的一系列疾病，为人类的身体健康提供保障。

食品微生物检验是食品质量管理的重要组成部分，它以“预防为主”为方针，能够有效避免或减少由食物引起的人畜共患病的发生，为人们的身体健康提供保障。食品微生物检验也是衡量食品卫生质量的主要指标，对于判定被检食品是否能够食用具有重要意义。通过食品微生物检验，能够判断食品加工环境及卫生情况，对食品受细菌污染情况作出准确评价，为各项卫生管理工作提供重要依据。我国微生物检验的主要食品类型包括奶制品、调味品、冷冻饮品、蛋制品和罐头食品等。

1.2 技术特点

对食品的微生物检验而言，需要检验的病原微生物类型繁多，且来源广泛，微生物受到其他因素影响极易导致传播，引发疾病。在实践工作阶段，工作人员应对相关内容进行详细记录，如病原菌类型、分布特点、菌落总数等，将实际检验得到的结果和预期标准限值进行对比，进而有效判断食品是否具有致病性，且根据病原菌类型等相关指标，进一步判断食品的情况，如变质物质的掺入时间等，如果其中一项指标超出正常区间，便可判定该食品与质量卫生要求不符。

2 微生物检测流程及内容

2.1 流程

首先对检验流程进行分析，按照食品检验机构的工作流程，在委托方下发任务、合同评审结束，明确检验资质后，便可进行食品的检验，具体步骤如下。①抽样检查。严格按照《国家食品监督抽检实施细则》中相关规定，安排专业人员进行抽检工作，对待检样品的类型、数量等信息进行认真核实，确保其满足检验要求。②样品核对。安排相关工作人员对接收样品进行逐一核对，具体内容包括外观、标识、检验用量等，并进行相应的照片采集。③样品制备。为了满足检验要求，应做好待测样品的制备工作，做好保护措施，确保其存储环境、条件适宜。④样品检验。工作人员严格遵守相关制度标准，做好试剂、仪器等的核对工作，检验时严格按照规范标准进行空白试验，保证样品的质量达标。⑤复测实验。检验后如果发现样品不达标情况，应及时按照项目特征进行复验，比较初验和复验的结果，明确导致数据差异的主要原因，确保检验结果的准确性。⑥建立原始记录，做好检验报告的校对、审核及签发工作，将最终获得的数据录入系统中[2]。

2.2 主要内容

有害微生物是检测技术的主要检测对象，这类微生物随着食物被人们摄入，极易引发一系列疾病，威胁人们的健康。微生物检测的具体内容包括以下4个方面。①大肠菌群。大肠菌群是主要病菌，具体包括肠杆菌属、克雷伯菌等，多源于肠道，在35 ℃的环境下可转化为革兰氏阴性菌。对食品进行检验的过程中，当大肠菌群结果为阳性，说明食品存在受污染情况，应进行进一步的检验。结合实际分析，如果食品中该类菌群的含量较多，说明食品存在粪便污染问题，因此可通过对菌群数量的检测判断食品受污染情况。②致病菌。致病菌是导致人体生病的细菌统称，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。不同食品的致病菌类型各不相同，检验人员应选择合适菌群。例如，对于海鲜类产品应加强对溶血性弧菌的检验，而米面类产品则需要加强对蜡样芽孢杆菌的检验。③霉菌及毒素。目前食品微生物检测中尚未明确霉菌指标，但霉菌极易生成毒素，进而引发食品安全问题，因此霉菌也是微生物检测技术的主要检测内容，易导致食物中毒及其他疾病的霉菌包括寄生曲霉、黄曲霉、岛青霉等[3]，应加以关注。④其他微生物。除了以上几种微生物外，其他微生物也极易引发疾病，导致食物中毒，如病毒类微生物，包括肝炎病毒、狂犬病毒、口蹄疫病毒；寄生虫类，包括肺吸虫、蛔虫、螨虫等，均可能引发食品安全问题，也是食品微生物检测的主要内容。

3 微生物检测的应用价值

近年来，随着社会经济发展水平的不断提高，人们的生活质量得到显著改善，对食品质量的要求也在不断提高，且食品安全关乎人们的切实利益，更应加强对食品质量的关注。食品检验的目的在于保障食品质量，防控疾病，同时为市场监管提供依据。以往我国的食品检验多采用物理及化学检验方法，实际应用效果欠佳，难以充分满足检验工作的要求。在此背景下，微生物检测技术为食品检验提供了全新的思路。在食品检验中采用微生物检测技术，能够有效检出食品中存在的有害微生物，同时该方法的适用性极强，对于动植物食材均能够有效检测。与其他检测技术相比，该类技术的成本低、准确性高，在食品质量评价、质量监管及生产过程监控中均具有极高的应用价值，对于保障食品安全具有重要意义。

4 微生物检测技术在食品检验中的运用

4.1 常规检测技术

4.1.1 生理生化技术

（1）ATP生物发光技术。它是目前常用的检测技术，对其原理进行分析，主要是在Mg2+与荧光素酶E的作用下，ATP和荧光素LH2出现腺苷酰化被活化，被活化后，荧光素与荧光素酶结合能够产生AMP复合体，同时也会产生一定数量的焦磷酸。在分子氧被复合体氧化后，能够促进复合物P*-AMP的生成，同时产生一定的二氧化碳。该复合物从激发态向基态转化的过程中，能够射出光，进而产生氧化虫荧光素P与AMP。对该项技术的检测流程进行分析，首先应明确ATP生物发光值，在此基础上绘制被检样品微生物含量标准曲线，之后进行取样、提取等处理，添加适量酶反应试剂，完成检测后，根据标准曲线检测维生素的数值。ATP生物发光技术目前多用于食品菌落总数的检测。菌落总数是食品检测的一项重要卫生指标，传统检测方法耗时长，效率低，对库存管理、生产销售等造成诸多不便，而通过采用ATP生物发光技术，与传统检测方法相比，检测结果快速且全面，能够在短时间内得到准确的结果。

（2）生物酶技术。这也是目前十分常用的一种微生物检测技术，该项技术能够基于对食品结构、性质的检测分析是否存在有害微生物，为食品安全提供保障。该项技术具有较高的准确度和灵敏度，目前应用广泛。

（3）微量生化方法。该方法用于分析细菌生长对外界环境的影响，进而明确细菌的类型和数量，主要包括热量法和放射测量法。在食品检验过程中，检测细菌生长过程中产生的具有放射性的二氧化碳含量，进而明确食物中细菌的数量；对细菌生长中产生热量的检测，能够明确细菌的类型。该项技术适用于食品微生物中细菌数量和类型的检测，且结果准确性较高。

4.1.2 免疫学检测技术

该项技术以免疫学相关理论知识为基础，能够有效检测食品中的微生物类型，常用检测方法为非标记免疫分析法，具体流程包括凝集、沉淀反应、补体参与和中和试验等，对样品中细菌、病菌等微生物的检测效果良好。且该项技术对检测仪器设备无较高要求，检测准确性较高，但因为涉及流程繁多，实际操作具有一定的复杂性，因此整体效率低下[4]。目前多用于一些配套仪器设施不完善的食品检验机构的检验工作中，常用的检测技术包括以下3种。

（1）免疫聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction， PCR）技术。该技术以分子作为主要标记物，在常规免疫反应的基础上，能够有效进行PCR扩增、电泳分析等操作，整体免疫试验效果理想。在食品微生物检测中采用该项技术，能够有效强化系统的扩增性能，提高抗原体反应的特异性，最大限度提高检测抗原应用的灵敏度，且因为所有DNA分支均为可选择的固定分子，合成一对引物后便可完成操作，有效避免检测对象变更需要更换引物等问题，有助于简化操作流程，优化操作模式。通过采用免疫PCR技术，可将生物素作为连接分子，且生物素在使用时具有独立的结合点位，其中一个点位与DNA分子有效结合，另外一个点位则与抗原-抗体复合物中的亲和素结合，实现DNA分子和抗原-抗体亲和素的整合，最终产生相互融合的复合物，之后进行PCR扩增处理，对DNA标记便可完成检测。

（2）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。对其原理进行分析，首先提取食品组织或食品细胞内的总RNA，将其中的mRNA作为模板，利用dT或随机引物，通过逆转录酶将提取物质转录为cDNA，将其作为模板，达到PCR扩增的效果，帮助工作人员了解目标检测基因的具体情况。在食品微生物检验中采用该技术可提高检测的灵敏度，甚至可提升多个数量级，实现对微量RNA样本的准确分析。例如，食品微生物检验中采用该项技术检测大肠杆菌噬菌体情况，将F-RNA平板作为阳性结果数据的主要依据，在SC和F-RNA噬菌体混合液中，实现对噬菌体的有效检测。

（3）巢式PCR技术。该技术能够构建两套引物达到PCR扩增处理的效果，利用内外部两对引物对靶基因片段进行扩增处理，首先采用一套引物扩增约20个循环，之后利用扩增后的DNA片段，进入另外一套引物的扩增循环，循环数约20个。在此过程中，第二套引物的设计片段位于第一套引物的扩增片段内，所以第一套引物可作为外引物，第二套引物作为内引物。此外，该项技术的应用不但能够有效提高整体反应的特异性，同时可为工作人员提供丰富的特异靶序列，提高整体检测的敏感度。在食品微生物检验中，能够实现对基因靶DNA的单拷贝扩增处理，保证食品检验效率和质量。

4.2 快速检测技术

4.2.1 生物传感器技术

生物传感器技术是一种采用生物传感器进行检测的快速检测技术。生物传感器的主要组成部分包括识别元件和转换元件，其优势在于实现生物反应技术和生物特征的有效融合，能够在生物传感器的识别系统中进行有效识别并分析，之后通过转换被测信号得到食品中的成分类型及有害物质含量。该项技术具有操作便捷、灵敏度高、精确性强、筛查快速、便于携带、在线监测及成本低等优势。作为一种多学科交叉的新型技术，目前已成为食品检测的主要手段。生物传感器技术能够对食品中有害微生物、病毒、农药及非法添加物等进行检测。例如，对食品样本中的细菌进行快速检测的过程中，能够通过细菌细胞内ATP和荧光素-酶试剂反应发光，将信号转化为电信号，最终通过光度计对细菌数量进行检测。但实际应用过程中也存在诸多不足，如稳定性不佳、使用寿命较短等。目前，生物传感器技术多用于食品中病原菌、农药残留的检测，实际应用具有一定的局限性，仍需要不断提高技术水平。

4.2.2 电阻电导检测技术

电阻电导技术是通过检测微生物代谢导致的培养基电特性变化情况来检测食品样品中微生物含量的一种快速检测技术。培养微生物时，受到生理代谢作用的影响，能够使培养基中电惰性物质转化为活性物质，脂肪代谢为重磷酸盐，大分子物质代谢为小分子物质。在微生物不断生长的过程中，培养基中的电惰性分子逐渐被活性分子和离子替代，导致导电性提升，电阻抗下降。微生物的起始数量存在差异，其指数增长期的时间也各不相同，通过建立两者间的关系，便能够采用该项技术测量出微生物的原始菌数。此外，该项技术也可用于食品保质期的判断。该项技术的使用通常需要借助微生物计数仪、全自动微生物检测仪等设备，结合电阻、电容等参数计算微生物具体数量，生成具备参考价值的数据，为检验人员判断食品是否达标提供依据。

4.2.3 质谱技术

质谱技术的应用涵盖诸多理论知识，如生物基因学、代谢组学等，在海鲜食品、发酵食品等食品类型检验中的应用价值较高。具体检测时，采用该项技术能够分离食品中的革兰氏阳性菌，并生成光谱指纹图谱列表，结合菌属特异性峰值、数量等指标进行细菌的检测。例如，对发酵食品进行检测，能够有效判断动物源双歧杆菌亚种的类型。该技术的使用可弥补分子生物学检测的不足，满足快速检验的要求。在具体检验过程中，工作人员通过运用液相色谱分离技术和质谱技术，能够高效检出食品中的菌种污染情况。

4.2.4 气相色谱技术

气相色谱技术是目前常用的一种快速检测技术，主要将惰性气体作为载体，将被检样品导入仪器后进行对比分析，通过气相色谱仪对气体、液体及固体进行全面分析。该项技术在气体混合物、固体以及易挥发液体中具有明显应用优势，对分离较为复杂的混合物进行检测，分离时间也非常短。混合物的组分会在气体流动相的带动下，逐渐流动到另一个固体或液体的固定相中，固定相对不同组分表现出的溶解和吸附能力不同，因此混合物组分在其中实际停留时间不同，进而能够分离成多个组分[5]。分离处理后，相关仪器能够按照相应顺序进行非电量转换，显示与各组分浓度对应的电信号，为工作人员记录、分析提供便利。

4.2.5 核酸探针技术

核酸探针技术主要包括核酸分子杂交技术、基因探针技术等，其作用为检测食品中不同的基因链，在此基础上明确食品中的微生物情况。不同核酸链的来源不同，其中的互补碱基序列在特异性结合的作用下能够生成分子杂交链，因此在已知DNA或RNA片段上进行探针标记便可有效检测微生物，即对食品中是否存在相同的序列进行检测。目前该检测技术在食品微生物检测中应用频率较高，适用于毒素、致病菌的检测。

4.2.6 低场核磁共振技术

低场核磁共振技术主要指磁性原子核磁场产生一定的作用，低能态原子核磁矩吸收交变场能量后达到高能态，这一现象便是核磁共振现象，同时生成相应的核磁共振信号。按照磁场的强度进行划分，高场核磁共振主要指恒定磁场强度＞1.0 T；中场核磁共振主要指恒定磁场强度为0.5～1.0 T；低场核磁共振主要指恒定磁场强度＜0.5 T。该技术利用物理原理，实现对谱线特征参数的有效检测，进而分析食品物质分子的内部结构。磁场的强度非常低，因此也是一种无损检测方法，能够最大限度维持物质的原有结构。该技术相较于传统检测技术，能够满足快速检测的要求，且具有绿色、环保的优势。在食品品质的检测中，不同食品的水分含量与保水性差异显著，采用该技术检验食品中的水品质，可准确分析食品品质，且具有无损、可重复性等优势。例如，对干制虾仁水分和品质检测的过程中，基于对核磁共振参数与结构、水分关系的分析，能够检测出食品中自由水和结合水的含量变化情况及扩散方向，满足高效无损检测的要求。此外，该技术还能够对食品添加水平和水分含量进行分析，有效检测其理化性质，保证食品质量。