铁皮石斛花黄酮含量及其自由基清除力分析

农彦彦，吴子瑜，林诗堃，黄 敏，冯才敏

（顺德职业技术学院 烹饪学院，广东佛山 528333）

铁皮石斛是近年来被大规模种植的《中华人民共和国药典》中的名贵中药材[1-2]。它能清肝、益胃、滋阴、润肺[3]，但由于药材和食材中主要使用的是铁皮石斛的茎，随着铁皮石斛人工栽培技术的发展，铁皮石斛花成为大量剩余的副产物[4-5]。目前有不少学者致力于研究铁皮石斛花的多糖类化合物、黄酮类化合物、氨基酸等生物活性成分[6-7]和挥发性功效成分[8]，及这些成分的抗氧化活性及其降血糖、降血压和调节免疫力等的功效[9-10]。如针对铁皮石斛花抗氧化活性较强的黄酮类化合物，杨兵勋等[11]通过研究发现铁皮石斛花具有与传统抗氧化活性较强的黄酮类化合物——大豆异黄酮提取物相当的抗氧化活性。但分析不同花期铁皮石斛花的自由基清除力及抗氧化活性的研究较少。因此，本试验通过对不同花期石斛花黄酮含量及其自由基清除能力进行测定分析[12]，为产量急增的铁皮石斛种植产业副产物——铁皮石斛花资源的开发利用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 样品

铁皮石斛花样品由顺德职业技术学院园林专业石斛组培课题组提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

1260 型高效液相色谱及二极管阵列检测器（安捷伦科技有限公司）；LE204E/02 型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ-500 型高频数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Lambda 25 型紫外分光光度计（天津博天胜达科技发展有限公司）。

1.2.2 试剂

芦丁对照品（纯度：95%）；甲醇（色谱纯）；乙酸（色谱纯）；七水硫酸亚铁（分析纯）、过氧化氢（分析纯）、水杨酸（分析纯）、Tris-HCl 缓冲溶液、邻苯三酚（分析纯）。

1.3 总黄酮含量的测定

1.3.1 芦丁对照品溶液的制备

准确称取适量芦丁对照品，加甲醇制备成浓度为0.1 mg·mL-1的溶液。

1.3.2 供试样品溶液的制备

准确称取供试样品粗粉1.000 g，同时准确量取50 mL 甲醇溶液，置于具塞锥形瓶中，称定重量，用超声处理（功率250 W，频率25 kHz）30 min 后，冷却称重，用甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，过滤。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇∶0.5%乙酸（V∶V）为38∶62；流速：1 mL·min-1；进样量：5 μL；检测波长：385 nm。

1.4 羟自由基清除能力分析

1.4.1 样品储备液的制备

准确称取0.488 g 待测样品，用乙醇溶液定容至100 mL，得8 mmol·L-1样品储备液。

1.4.2 试剂空白

取25 mL 比色管，记为对照试验组，依次向其中加入2 mL FeSO4溶液、0.1 mL 双氧水溶液并摇匀，然后向其中加入0.1 mL 水杨酸，摇匀，用蒸馏水定容至25 mL，快速使用紫外分光光度计在波长为510 nm处检测吸光度。设定为空白组，结果记为A0，具体加样情况如表1所示。

1.4.3 不同浓度同花期样品羟自由基清除力分析

取5 支洁净的比色管，分别编号为1、2、3、4、5，依次向其中加入2 mL FeSO4溶液、0.1 mL 双氧水溶液并摇匀，随后分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 样品储备液定容至100 mL，振荡摇匀，放入水浴锅中，37 ℃温水水浴15 min 后加入0.1 mL水杨酸，振荡摇匀，蒸馏水定容至25 mL，快速使用紫外分光光度计测定510 nm 处的吸光度，结果记为Ax。同时做对照样品对比（0.1 mg·mL-1芦丁对照品）。

1.4.4 羟自由基清除率的计算

3 种黄酮类化合物羟自由基的清除率的计算公式为

式中：A0为对照（空白）试验的吸光度值；Ax为待测样品吸光度值；所有实验结果是3 次测定数据的平均值。

1.5 超氧阴离子清除能力分析

1.5.1 样品储备液的制备

准确称量0.610 g 待测样品，用乙醇溶液定容至100 mL，得10 mmol·L-1样品储备液。

1.5.2 空白组的测定

取1 支洁净比色管，加入4.5 mL Tris-HCl 缓冲溶液，置于25 ℃水浴中加热20 min，加入1 mL 蒸馏水和0.4 mL 邻苯三酚溶液，混匀后置于25 ℃水浴反应5 min，加入1 mL HCl 溶液终止反应，325 nm处的测定吸光度值，结果记为A0。

1.5.3 不同浓度同花期样品超氧阴离子清除力分析

取5 支洁净比色管，加入4.5 mL Tris-HCl 缓冲溶液，置于25 ℃水浴中加热20 min，分别加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL 和5 mL 的样品储备液定容至100 mL。再加入0.4 mL 邻苯三酚溶液，混匀后置于25 ℃水浴中反应5 min，加入1 mL HCl 溶液终止反应，325 nm 处测定吸光度值，结果记为Ax，同时做对照样品对比（0.1 mg·mL-1芦丁对照品）

1.5.4 超氧阴离子清除率的计算

超氧阴离子清除率计算公式为

式中：A0为对照（空白）试验的吸光度值；Ax为待测样品吸光度值。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 样品HPLC 图谱分析

芦丁对照品和供试铁皮石斛花样品溶液高效液相色谱分析图谱（图1、图2），说明供试铁皮石斛花中含有黄酮类化合物（以芦丁计）。

图1 芦丁对照品谱图

图2 石斛花样品谱图

2.1.2 标准曲线

取芦丁对照品溶液，进样量为0.4 μL、0.8 μL、1.2 μL、1.6 μL 以及2.0 μL，以峰面积（A）为纵坐标，以芦丁质量（μg）为横坐标，进行线性回归。结果如图3所示，表明芦丁在0.04～0.20 μg 具有良好线性关系。

图3 芦丁对照品标准曲线

2.1.3 不同花期石斛花黄酮含量

由表1可知，铁皮石斛花微花期中总黄酮含量比盛花期总黄酮含量高。

表1 不同花期石斛花黄酮含量

2.2 羟自由基清除力分析

由图4可知，微花期和盛花期石斛花试样的羟自由基清除能力均随浓度增加而增强，且微花期羟自由基清除能力与对照样品相当，比盛花期强。

图4 样品羟自由基清除力

2.3 超氧阴离子清除力分析

由图5可知，微花期和盛花期石斛花试样的超氧阴离子清除能力均随样品的浓度增加而增强，且微花期羟自由基清除能力与对照样品相当，比盛花期强。

图5 样品超氧阴离子清除力

3 结论

本文通过高效液相色谱法对不同花期铁皮石斛花中总黄酮含量进行测定分析。实验结果显示，微花期铁皮石斛的黄酮含量比盛花期铁皮石斛黄酮含量高；同时通过羟自由基和超氧阴离子清除力实验验证了石斛花具有一定的抗氧化能力，且微花期石斛花的抗氧化能力比盛花期强，为合理利用富余的铁皮石斛花资源提供了理论参考依据。