UPLC-MS/MS法快速测定水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考残留量

李 龙

（龙口市检验检测中心，山东龙口 265701）

我国是世界渔业大国与水产品进出口贸易强国，但每年仍不可避免地存在因水产品兽药残留问题导致的贸易纠纷，归其原因主要是养殖密度过高、池塘的消毒处理不严格及反复使用以及环境污染等影响，导致水产养殖动物的病害严重。部分养殖户在养殖过程中由于养殖经验的缺乏，规避经济风险的考虑，经常会滥用抗生素及超剂量使用兽药，这些药物降低了水生动物的发病率与死亡率，也引发了药物的滥用、违禁使用等一系列问题[1]。其中，氯霉素类药物作为一种低成本、高效、抗菌谱广的抗生素被广泛使用，氯霉素类药物主要包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考（氟甲砜霉素），对于治疗水产品的传染性疾病均有显著效果。其中，氯霉素因具有可导致人和动物的再生障碍性贫血、免疫抑制强的副作用，在农业农村部公告第250 号中已禁止使用。甲砜霉素的血液毒性虽然变弱，但仍具有较强的免疫抑制作用，且抗菌效果弱于氯霉素。氟苯尼考作为新型的氯霉素药物，具有不易产生耐药性、安全性高、抗菌活性强、体内吸收效果好以及生物利用率高等优点。但因具有胚胎毒性，其在水产食品中的残留检测逐渐受到重视[2]。为了确保消费者的健康，欧盟、美国、中国等国家或组织已严格禁止在动物源食品中使用氯霉素药物，并对氯霉素类药物的最高残留量作出了规定[3-6]。由于氯霉素类药物在水产品中的残留量很低，这就需要利用高灵敏度、低检测限的检测方法测定。色谱-质谱联用技术具有分离能力强、分离效率高以及灵敏度高等优点，适合低残留组分的检测。而UPLC-MS /MS 分析方法除了具有上述共性优点，还具有分析时间短，能分析极性强、不易挥发和热稳定差的化合物，自动化程度高，能满足大批量样品检测的能力。三重四极杆串联质谱既可以对目标物定性又可以定量，不仅使结果更加准确，也解决了其他仪器检测存在的假阳性与基质干扰的问题。HAMMACK 等[7]对气相色谱法测定氯霉素残留量的方法进行改进，选用液质联用检测技术进行检测。结果表明，该方法具有更高的灵敏度。张静等[8]利用高效液相色谱-ESI 串联质谱法测定鸡肉、鸡蛋中的氯霉素类药物残留量，该方法前处理简单，方法的定量限为0.1 μg·kg-1，满足残留检测限量的要求，为本课题的研究提供了实验基础。

1 仪器与方法

1.1 材料、试剂与仪器

空白鲤鱼市售（检测后不含氯霉素类抗生素）。

乙腈（色谱纯）；正己烷（色谱纯）；标准物质氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（100 μg·mL-1单标，中国计量科学研究院）和氚代氯霉素（d5-CAP）（100 μg·mL-1，中国计量科学研究院）。

超高效液相色谱- 串联质谱仪（Waters Xevo TSQ Micro）配ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国沃特斯公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；SFTGL-18R 离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）；HSC-24B 氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.2 色谱条件与质谱条件

1.2.1 色谱条件

C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；流动相：水（A）-乙腈（B）；流速：0.25 mL·min-1。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

离子源：ESI 离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM 多反应监测；电喷雾电压：-3 000 V；辅助气温度：500 ℃；锥孔气流速：50 L·hr-1；雾化气流速：800 L·hr-1；碰撞气：氩气。其他质谱参数见表2。

表2 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的质谱条件

1.3 溶液的配制

分别准确量取浓度为100 μg·mL-1的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考标准物质各1 mL，用乙腈定容至10 mL，配成10 μg·mL-1的单标标准储备溶液，再配成1 μg·mL-1的混合标准储备溶液，于-18 ℃冰箱保存。根据工作液的需要，再以乙腈稀释至适当浓度，现用现配。准确吸取适量氘代氯霉素标准溶液，用乙腈配成100 ng·mL-1的内标标准溶液。

1.4 样品前处理

1.4.1 试样的制备

将市售的淡水鱼去掉头、骨及内脏，取肌肉、鱼皮等可食部分约500 g，绞碎混合均匀后备用[9]。

1.4.2 提取

准确称取试样5 g（精确至0.01 g），置于50 mL聚四氟乙烯的离心管中，加入200 μL 的100 ng·mL-1氘代氯霉素内标标准溶液和25 mL 乙腈，涡旋混匀30 s，超声提取30 min，8 000 r·min-1离心10 min，取5 mL 上清液于氮吹管内，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈-水溶液（V∶V=3∶7）溶解残渣，涡旋混匀，加入5 mL正己烷液液萃取除脂，涡旋混匀，8 000 r·min-1离心10 min，去除正己烷层，取下层清液过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS/MS 测定。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考均以氘代氯霉素为内标，内标法定量。

1.5 基质标准曲线的绘制

根据标准曲线的浓度范围，准确吸取适量浓度的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考混合标准工作液适量，添加40 μL 的100 ng·mL-1氘代氯霉素内标标准溶液混匀，用提取的阴性基质溶液定容至1 mL，配制成浓度为0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的基质混合标准溶液，过0.22 μm 滤膜后，供液相色谱-质谱仪测定。基质标准曲线的纵坐标为定量离子峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值，横坐标为混合标准溶液中被测组分浓度与氘代氯霉素浓度的比值。

1.6 检出限、定量限的测定

本实验采用信噪比的方法来评估方法的检出限与定量限，通过向空白基质样品中添加目标组分的混合标准溶液，做6 个平行实验，测定其信噪比，当目标组分的特征离子峰与基线噪音值的比值＞3 时为方法检测限（LOD），信噪比＞10 为方法定量限（LOQ）。

1.7 准确度与精密度的测定

利用向阴性基质样品添加目标组分进行添加回收实验，采用3 个浓度的添加回收，使鱼肉中氯霉素的实际添加量为0.1 μg·kg-1、0.5 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1，甲砜霉素、氟苯尼考的实际添加量为1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1，每个浓度做6 个平行，按1.4进行样品前处理，计算加标回收率。精密度是通过相对标准偏差的比值来评估的。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

液相色谱的主要优化条件为流动相的选择与梯度洗脱程序的建立，考虑3 种目标组分的化学性质为弱极性的碱性化合物，并对乙腈、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂有极强的溶解性。有机相比较了液相质谱仪常用的流动相甲醇与乙腈，实验发现利用甲醇作流动相的分离效果比乙腈好，但是使用甲醇流动相时，柱压相对较高，使用乙腈流动相时，3 种物质的峰形尖锐，响应信号高，满足实验的要求。水相比较了水、5 mmol·L-1乙酸铵溶液、0.1%甲酸水3 种流动相，水相的酸碱度对于3 种物质的分离效果影响不大，对质谱响应值也无明显影响。考虑乙酸铵溶液为盐溶液，如果洗脱不干净容易造成仪器的故障，综合考虑选择水-乙腈流动相进行分离。梯度洗脱程序先减少初始有机相比例，避免因初始有机相比例过高出现极性峰，根据目标组分极易溶于有机相中，故目标化合物会随着流动相中有机相比例的增加先流出，再降低流动相中有机相的比例，色谱柱中残存的干扰杂质被洗脱，梯度洗脱程序既能提高分离能力又能减少杂质的干扰。

2.2 质谱条件的优化

由于氯霉素类物质电负性较强，故采用负离子扫描模式，该扫描模式下得到的准分子离子峰m/z320.9[M-H]–单一，可避免样品中的基质带来的干扰，响应信号高，色谱峰的峰形也好[10]。利用直接从质谱进样的方式，先对3 种目标组分进行一级质谱MS Scan，确定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的母离子分别为m/z320.9、353.9、355.9，并确定各自的锥孔电压。然后固定上述母离子及锥孔电压，进行子离子扫描，在此质谱条件下，氯霉素主要产生m/z257.0，151.9等子离子；甲砜霉素主要产生m/z289.9、226.9、184.9等子离子；氟苯尼考主要产生m/z118.9、184.9、335.9等子离子。选择丰度最强的m/z257.0，151.9 作为氯霉素定性、定量离子；m/z289.9 和184.9 作为甲砜霉素的监测离子；m/z335.9 和184.9 作为氟苯尼考的监测离子。在上述监测离子中选用相对离子丰度强的子离子作为定量离子，并对各子离子的碰撞能量进行优化，最终确定多反应监测的条件如表2所示。

2.3 方法的线性范围、检出限

本研究发现，在0.1～10.0 ng·mL-1，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的定量离子峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值与目标组分浓度与氘代氯霉素内标浓度的比值均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.990，见表3。当3种组分的添加浓度水平为0.1 μg·kg-1时，平均信噪比分别为4.2、4.4、5.7，均大于3，证实本方法氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的检出限均为0.1 μg·kg-1。

表3 标准曲线相关参数

2.4 准确度和精密度

由表4可知，回收率实验满足化学分析方法确认中对方法回收率偏差范围的规定，即当添加浓度小于0.1 mg·kg-1时，回收率为60%～120%[11]。平行实验的相对标准偏差均小于20%，表明结果重复性好，精密度高。

表4 回收率及精密度测定结果

3 结论

本研究先利用质谱调谐确定各目标组分的质谱参数，再筛选高分离效果的色谱条件，不断简化、优化样品前处理步骤，建立了UPLC-MS/MS 快速测定水产品中氯霉素类药物残留的分析方法，通过系列验证实验证明该方法的灵敏度、准确度均能满足低残留限量氯霉素类药物分析的要求。本方法同时具有有机溶剂消耗少，实验周期短等优点，能同时满足对氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考3 种药物的多残留检测。