婴幼儿配方食品中肌醇含量的检测方法研究

陈羽中，谭锦萍，戚 平，周庆琼，陈 婷，黄小清

（广州市食品检验所，广东广州 511410）

婴幼儿食品中肌醇含量检测的标准方法为GB 5009.270—2016第二法气相色谱法[1]，气相色谱法灵敏度高，但衍生过程较为烦琐，在测定婴幼儿乳粉、奶制品、功能饮料等样品时费时不易操作[2]，特别是在干燥这个步骤中，往往1批30个的样品需要花费24 h进行干燥处理，步骤也很烦琐，需要分几步转移样品[3]。另外由于婴幼儿奶粉的基质复杂，往往在衍生后的提取中会出现严重乳化现象，难以得到澄清的提取层，进样液也常发现有溶剂浑浊的现象，色谱图可见明显的基质干扰[3]。为了解决以上问题，本实验对前处理过程进行了方法优化，改变了干燥方法，增加了净化步骤，使上述问题得到了显著改善，解决了以往的技术难题，为本实验提高了工作效率。

1 材料与方法

1.1 实验原理

本实验将试样中的肌醇用水和乙醇提取后，分取提取液进行氮吹干燥，加入硅烷化试剂衍生，正己烷提取后经水洗净化，经气相色谱分离，外标法定量。

1.2 材料与试剂

材料：婴幼儿乳粉（市售）；肌醇标准物质（99.9%，德国，Dr Ehrenstorfer公司）；质控样品为婴幼儿/成人营养食品（National Institute of Standards and Technology，NIST），SRM/RM编号：1849a，Order编号：1905870。

试剂：无水乙醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（99.9%，上海，安谱公司）；三甲基氯硅烷/TMCS（≥99%，REGIS）；六甲基二硅氮烷（≥98%，美国，阿法埃莎（Alfa Aesar）；正己烷（色谱纯，美国Fisher Chemical公司）；无水硫酸钠（色谱纯，德国Sigma公司）；硅烷化试剂：三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷和N,N-二甲基甲酰胺按体积比1∶2∶8混合超声后无白色浑浊，现配现用。

1.3 仪器与设备

8890气相色谱仪：配氢火焰离子化检测器（美国Agilent公司）；MS204TS/02 万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超纯水机（美国Milipore公司）；MS 3digital 涡旋混合器（德国IKA公司）；2600TH型数控超声波清洁器（上海安谱公司）；2-16KL 型高速离心机（德国Sigma公司）；N-EVAPTM112 氮吹仪（美国Organomation公司）；SW22振荡水浴锅（德国Julabo公司）；色谱柱：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm，美国 Agilent公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 样品前处理

提取：称取1 g（精确到0.1 mg）样品于50 mL离心管中，加入40 ℃一级水12 mL溶解并超声提取10 min，用95%乙醇定容至50 mL，摇匀静置20 min后于6 000 r·min-1离心3 min。过滤后取上清液5 mL于25 mL衍生瓶。

干燥：向衍生瓶中加入2 mL无水乙醇，在80 ℃水浴下氮吹至干后放烘箱中100 ℃烘干1 h。

衍生提取：向上述衍生瓶中加入5 mL硅烷化试剂，立马盖上盖子，超声溶解5 min后放于80 ℃水浴振荡中振摇45 min后取出冷却至室温。加入5 mL正己烷，涡旋混合30 s后于8 000 r·min-1离心3 min。

水洗净化：取上层液2 mL加入2 mL水摇匀后于8 000 r·min-1离心3 min，取上层液于预先加少许无水硫酸钠的15 mL离心管中，涡旋后过0.4 μm的滤膜，待测。

1.4.2 标准工作溶液的制备

肌醇标准溶液（0.100 mg·mL-1）：称取 50 mg（精确到0.1 mg）的肌醇标准物质，用25 mL水溶解并用95%乙醇定容至50 mL，摇匀。取1 mL此溶液，用70%乙醇稀释至10 mL。分别吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL肌醇标准溶液于衍生瓶中，按上述1.4.1步骤进行“衍生提取”操作。

1.4.3 仪器条件

进样口温度：280 ℃；分流比10∶1；柱温：起始温度 60 ℃，以 20 ℃·min-1升到 240 ℃，保持1 min；然后以20 ℃·min-1升到260 ℃，后运行300 ℃，保持3 min。恒定流量：1.8 mL·min-1；进样量：1 μL；检测器（FID）温度：300 ℃。

1.4.4 计算公式

样品中肌醇的含量X按以下公式计算：

式中：X为样品中肌醇含量，mg/100 g；C为从标准曲线中获得试样测定液肌醇的含量，μg；f为试样测定液所含肌醇换算成试样中所含肌醇的系数为10；m为试样的质量，g；100为换算系数。

2 结果与分析

2.1 两种方法对比

2.1.1 干燥时间对比

两种干燥方法处理时间对比见表1。前处理干燥的步骤改用氮吹代替旋蒸，既节省了溶剂使用量也大大缩短了实验时间，平均每个样品可缩短12.5 min的干燥时间，有效提高实验效率。本方法前处理简单，需要很少的有机溶剂，对操作者和环境的危害小。

表1 两种干燥方法处理时间对比

2.1.2 水洗净化前后样液对比

上机样品对比见图1。由图1可知，增加的水洗步骤能使样品得到进一步净化，消除正己烷提取后的乳化现象。

2.1.3 色谱图上的背景干扰对比

色谱图上的背景干扰对比见图2和图3。由图2和图3可知增加的水洗步骤能使样品得到进一步净化，减少由于杂质给仪器带来的污染及有效减少色谱图上的背景干扰，有效提高定性和定量的准确性。

2.2 方法验证

（1）通过采用质控样品分别按照方法优化前与方法优化后进行试验，得到样品结果与证书值（405.2±7.6）mg·kg-1做比较，每方法各平行6个样品。

优化前方法回收率在103.1%～114.7%，重复性条件下平行6样结果的变异系数为3.70%，标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.993。优化后方法回收率在98.7%～101.7%，符合GB/T 27404—2008附录F中回收率95%～105%（含量＞100 mg·kg-1时）的要求。重复性条件下平行6样结果的变异系数为1.14%，符合GB/T 27404—2008附录F中变异系数的要求；标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.998，线性范围满足标准的要求。可见，优化后方法具更高的准确度和精密度，见表2。

表2 两种前处理方法质控样品结果比较

（2）选择质控样品通过人员比对实验对方法进行确认。人员独立测定结果的回收率分别为99.8%和100.1%，准确度和精密度均符合标准要求；标准曲线在10～200 μg时，校正方程的相关系数均为0.999，线性范围满足标准的要求。不同人员独立测定结果的相对偏差为0.30%，人员比对结果符合不同人员独立测定结果相对偏差不大于10%的验证方案要求。见表3。

表3 质控样品人员比对结果

经验证，新建立的方法有效解决了肌醇检测技术中的难点，优化后方法的各项技术指标均达到标准要求，表明该检测方法是有效的，满足项目开展的要求，符合预期用途。

3 结果与讨论

在肌醇检验检测的前处理过程中，涉及衍生化的操作，目前主要是分为完全衍生化和非完全衍生化，其各自的产物不同，完全衍生化生成的是一个硅氧环己烷，不完全衍生化生成的是两种产物[4]。而其衍生化程度与反应过程的温度有关，当水浴温度在70 ℃以下，待测物肌醇不能与硅烷化试剂结合生成结构稳定的六（三甲硅氧基）环己烷，而是生成结构不稳定的β-四联树胶醛醣和五（三甲硅氧基）肌醇[5]；当水浴温度分别为80 ℃、90 ℃时，硅烷化反应完全，反应产物是单一的、结构稳定的六（三甲硅氧基）环己烷；如果水浴达到90 ℃或以上时，生成的产物由于水浴温度太高而易挥发，导致其测定值的浓度降低，影响检验结果的准确性。

总结以上实验方法，除反应对温度敏感，还涉及人员在以下方面的实验操作注意事项：①对于N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅烷胺烷，必须保证当三者混合后无白色浑浊现象时方可使用；②硅烷化试剂放干燥柜中保存，避免吸水；③衍生实验过程应严格避免有水。