植物甾醇纳米粒降低高胆固醇HepG2细胞内胆固醇的作用效果研究

焦文佳，石剑夫，黄志芬，陈颖怡，祝爱侠，王春维,5

（1．广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442；2．广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；3．广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442；4.武汉轻工大学 动物科学与营养工程学院，湖北武汉 430023；5.国家粮食局粮油资源综合开发工程技术研究中心，湖北武汉 430023）

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架的醇类化合物，是构成植物细胞膜的活性成分之一，其中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇等是最常见的天然植物甾醇[1]。此外，植物甾醇与胆固醇两者结构类似，主要骨架均为环戊烷全氧菲（甾核），是四环三萜类化合物，属于无甲基甾醇，手性结构相同。近年来，植物甾醇成为食品热门营养元素之一，被科学家们誉为“生命的钥匙”，具有许多十分重要的生理功效，如降低胆固醇、抗炎、抗氧化和抗癌等作用[2]。当人体摄入过多的胆固醇时，肝脏等器官自动调节胆固醇的吸收和排泄的功能会发生障碍，多余的胆固醇不能正常排出体外，会导致血清中胆固醇升高，造成高胆固醇血症或高血脂症[2]。人体摄入植物甾醇后，由于其结构与胆固醇十分相似，会在肠道内与胆固醇竞争乳糜微粒表面的吸附位点从而降低胆固醇的吸收[3]；当二者共存于肠腔内时，可共同结晶沉淀，形成不溶物排出体外，进而达到降低胆固醇的作用[4-5]；同时，植物甾醇还能通过影响相关酶的活性，抑制胆固醇在肝脏内的生物合成及代谢[6]。

植物甾醇具有降低胆固醇的作用，能够降低人群高胆固醇血症的发生概率，但存在高熔点、低溶解度和低生物利用度等一系列问题，进而严重影响其食品品质、应用价值和范围[7]。在食品工业中，主要是对植物甾醇进行物理、化学改性处理，以此来改善其溶解性或分散性，更好地利用其生理功效。物理改性形成的体系主要有纳米粒、微/纳米乳液、微/纳米胶囊、脂质体等。周士娇等[8]采用超声辅助反溶剂沉淀法制备出粒径为252.77～215.90 nm、包封率为95.39%～81.55%的乳清分离蛋白-植物甾醇纳米颗粒，所得纳米颗粒具有良好的稳定性，有利于小肠对植物甾醇的吸收，发挥其抑制胆固醇吸收的作用。骆兆娇等[9]采用高压微射流技术制备出豆渣蛋白-植物甾醇纳米颗粒（OP-PS），所得OP-PS纳米颗粒粒径为139.28 nm，包埋率达98.63%，且具有较好的稳定性和水分散性。在前期研究中，本课题组运用现代纳米技术制备出一种粒径小[（93.35±1.222）nm]、分布均匀、稳定性良好的植物甾醇纳米粒[10]。

目前，关于植物甾醇降低胆固醇效果的研究较多，但植物甾醇纳米粒的制备改变了植物甾醇的溶解性、稳定性及吸收效率等，其降胆固醇效果需进行进一步探究。细胞水平试验可在一定程度上消除器官试验中细胞间的复杂作用，或体内试验中神经体液调节的干扰，考察药物直接作用于细胞的结果[11-12]。人肝癌细胞HepG2细胞虽为一种癌细胞，但其生物学特征与正常肝细胞相近[13]，并含有与人正常肝细胞具有同源性的生物转化代谢酶，其具有较高的分化程度，保留性较完整且具有稳定的活性，便于进行传代培养，是国际公认的研究降脂作用的细胞系[14-15]，广泛用于模拟人体正常肝脏细胞，且常用于毒理学和肝脏保护等研究[16-17]。为更好地了解前期所制备的植物甾醇纳米粒的降胆固醇效果，本研究以人肝癌细胞株HepG2细胞为辅助研究对象，观察不同剂量植物甾醇纳米粒对高胆固醇诱导的HepG2模型细胞内胆固醇含量的影响，从体外试验研究明确植物甾醇纳米粒的降胆固醇效果，为植物甾醇纳米粒的应用提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物甾醇（≥95%），武汉远成共创科技有限公司；大豆卵磷脂（≥70%），阿拉丁试剂有限公司；大豆分离蛋白（≥95%），新西兰恒天然有限公司；HepG2细胞，上海中科院细胞库；辛伐他汀（细胞级），MedChemExpress（MCE）公司；胆固醇，美国Sigma公司；96孔培养板、冻存管，Corning公司；70 mm细胞培养皿，JETBIOFIL公司。

DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、PBS缓冲液，Gibco公司；0.25%胰蛋白酶溶液，杭州吉诺生物医药技术有限公司；双抗（PS，青霉素、链霉素），Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO），美国Sigma公司；MTS，普洛麦格（北京）生物技术有限公司；组织总胆固醇酶法测定试剂盒（E1015），北京普利莱基因技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）、RIPA裂解液（强）、PMSF（100 mmol·L-1），碧云天生物技术研究所；总胆汁酸（Total Bile Acid，TBA）测试盒、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）测试盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

INC108 CO2培 养 箱，德 国Memment公 司；TDZ5-WS 离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；XD-30倒置显微镜，宁波舜宇仪器有限公司；iMark酶标仪，美国BIO-RAD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同浓度植物甾醇纳米粒（PNP）的制备

按照前期研究[10]所得植物甾醇纳米粒的最佳制备工艺条件制备植物甾醇纳米粒，主要制备工艺如下。制备浓度为0.75%（w/w）大豆分离蛋白（SPI）分散液，4 ℃水化过夜；将植物甾醇与卵磷脂按1∶4（w/w）比例溶解在16 mL无水乙醇中，形成有机相；对SPI分散液进行高速分散（转速为10 000 r·min-1），并将有机相缓慢注入其中，之后继续分散5 min；所得混合溶液通过高压均质（均质压力为900 bar，均质次数为6次）形成稳定的植物甾醇纳米分散液，旋转蒸发除去乙醇，加水稀释，得到试验所需不同浓度的植物甾醇纳米粒（PNP）。

1.3.2 HepG2细胞培养

HepG2细胞于完全培养液（含10%FBS+1%PS+89%高糖DMEM培养基）中恒温静置培养，每隔2～3 d更换一次培养液。培养期间应注意用显微镜观察细胞有无被污染及细胞的生长情况，待细胞生长密度达到70%～80%时，即可进行细胞传代。进行2～3次传代至细胞生长情况稳定后进行下一步细胞试验。HepG2细胞培养的具体操作参考文献[18]中的方法。

1.3.3 植物甾醇纳米粒和辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响测定

为确定后续试验中植物甾醇纳米粒和辛伐他汀的作用浓度，本试验采用MTS方法测定植物甾醇纳米粒和辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响。

试验分为空白组、空白对照组、植物甾醇纳米粒组（PNP，6个浓度）和阳性药物辛伐他汀组（Sim，5个浓度），每组设6个复孔。PNP的干预终浓度分别是50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1、600 μg·mL-1和800 μg·mL-1；Sim干预终浓度为10 μmoL·mL-1、20 μmoL·mL-1、30 μmoL·mL-1、40 μmoL·mL-1和50 μmoL·mL-1；空白组为培养基；空白对照组为细胞+培养基。

按照MTS试剂盒说明书的要求检测在植物甾醇纳米粒和辛伐他汀中分别培养6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后HepG2细胞活力。按下列公式计算细胞活力，由此得出植物甾醇纳米粒及辛伐他汀作用浓度及作用时间范围。

1.3.4 高胆固醇HepG2细胞模型的建立

按照1.3.2的方法对细胞进行常规培养，将对数生长期的细胞消化、悬浮，细胞悬液均匀铺在6孔板中。试验分组如下。①正常组。常规培养的细胞。②模型组。含0.20 mmol·L-1胆固醇的培养基培养的细胞。③阳性药物Sim组。含0.20 mmol·L-1胆固醇、20 μmoL·mL-1Sim的培养基培养的细胞。④PNP组。含0.20 mmol·L-1胆固醇、不同浓度的PNP（50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）的培养基培养的细胞；每个处理6个重复。作用24 h后，收集每孔中的培养基和细胞，按照相应试剂盒的要求处理。

1.3.5 培养基和细胞内总胆固醇含量的测定

试验结束后，收集培养基和细胞，按试剂盒说明书要求加入适量的细胞裂解液进行细胞裂解，并于室温2 000×g离心细胞和培养基，于550 nm波长下测定各孔OD值，根据标准曲线分别计算培养基和细胞内总胆固醇的浓度。

1.3.6 培养基和细胞内总蛋白含量测定

按照蛋白浓度测定试剂盒（BCA法）说明书要求，分别将1.3.5中余下的细胞裂解液和培养基于室温以（10 000～14 000）×g离心3～5 min，取上清液用于测定。于562 nm波长下测定各孔OD值，根据标准曲线和使用样品的体积分别计算出培养基和细胞内总蛋白含量。

1.3.7 培养基中总胆汁酸（TBA）含量的测定

将收集到的细胞培养基进行离心，按照试剂盒说明加入标准品或待测样本、试剂一和试剂二，混匀，37 ℃孵育1.5 min后，于405 nm波长下测定各孔OD值，计算培养基中TBA的含量为

1.3.8 细胞内抗氧化指标测定

严格按照超氧化歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒说明测定上述细胞裂解液中这两种抗氧化指标的活力，并用样本中所含的蛋白浓度来进行校正，相关计算公式为

1.4 数据处理

实验数据以平均数±标准误差（x—±SEM）表示，两组间比较用SPSS 17.0统计分析软件进行t检测，多组间比较采用one-way ANOVA检测，以P＜0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 植物甾醇纳米粒对HepG2细胞活力的影响

HepG2细胞经过不同浓度的植物甾醇纳米粒分别干预6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后，其细胞活力大小如图1所示。与空白对照组相比，不同浓度植物甾醇纳米粒分别作用HepG2细胞不同时间后，对HepG2细胞活力均有极显著的影响（P＜0.001）。在6 h和12 h内，经所有浓度的植物甾醇纳米粒作用后的HepG2细胞活力仍均在90%以上；在24 h和48 h内，800 μg·mL-1植物甾醇纳米粒作用下的HepG2细胞活力分别为88.8%和87.3%，其他浓度植物甾醇纳米粒处理下的HepG2细胞活力均在90%以上；在72 h内，600 μg·mL-1和800 μg·mL-1植物甾醇纳米粒干预下的HepG2细胞活力分别为89.1%和87.2%，其他浓度植物甾醇纳米粒干预的HepG2细胞活力均在90%以上。同一浓度的植物甾醇纳米粒培养细胞不同时间后，随着培养时间的延长，HepG2细胞活力越来越低（P＜0.001）；相同时间内，随着植物甾醇纳米粒浓度的增大，HepG2细胞活力极显著降低（P＜0.001），说明植物甾醇纳米粒对HepG2细胞活力的影响呈现剂量和时间效应。当细胞活力低于80%时即认为该药物具有细胞毒性[19]。从试验结果来看，在试验浓度和作用时间范围内，植物甾醇纳米粒不具有细胞毒性，所以可以根据试验需要选择所需浓度和时间，但由于植物甾醇纳米粒为淡黄色，考虑到颜色对吸光度的影响，故选择浓度分别为50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的植物甾醇纳米粒进行后续试验。

图1 植物甾醇纳米粒对HepG2细胞活力的影响

2.2 辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响

因试验需选用辛伐他汀（Sim）作为阳性对照，故考察了不同浓度的辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响，结果如图2所示。不同浓度的辛伐他汀干预HepG2细胞不同时间后，细胞活力较空白对照组均极显著降低（P＜0.001）。相同时间内，HepG2细胞活力随着辛伐他汀浓度的增大而极显著降低（P＜0.001），相同浓度的辛伐他汀干预细胞不同时间后，HepG2细胞活力随着干预时间的延长而极显著降低（P＜0.001），说明辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响呈现明显的剂量和时间效应。在6 h、12 h和24 h内，50 μmoL·mL-1Sim干预下的HepG2细胞活力分别为85.0%、81.1%和80.2%，其他浓度Sim干预下的HepG2细胞活力大于90%；在48 h内，40 μmoL·mL 和50 μmoL·mL-1Sim作用下的HepG2细胞活力分别为89.4%和77.8%，其余浓度的Sim处理下的HepG2细胞活力均在90%以上；在72 h内，5个浓度Sim干预下的HepG2细胞活力分别为93.2%、89.9%、89.0%、87.0%和75.9%。从试验数据可看出，50 μmoL·mL-1Sim在作用HepG2细胞超过24 h后呈现出细胞毒性，其他浓度的Sim在相应的作用时间内不具有细胞毒性。综合试验结果考虑，选用20 μmoL·mL-1Sim进行后续研究。

图2 辛伐他汀对HepG2细胞活力的影响

2.3 植物甾醇纳米粒对HepG2培养基和细胞内总胆固醇含量的影响

不同浓度的植物甾醇纳米粒对培养基和细胞内总胆固醇含量的影响如图3所示。模型组细胞内总胆固醇含量极显著高于正常组（P＜0.01），经不同浓度的植物甾醇纳米粒处理后，各处理组细胞内总胆固醇含量均极显著低于模型组（P＜0.01）。其中 浓 度 为50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇纳米粒组的细胞内总胆固醇含量较模型组分别降低了16.97%、23.80%、30.36%和39.71%（P＜0.01），但均极显著高于正常组（P＜0.01），不同浓度植物甾醇纳米粒组组间差异极显著（P＜0.01）。说明植物甾醇纳米粒能有效降低高胆固醇细胞内总胆固醇含量，同时具有极显著的剂量效应，但在试验浓度范围内，其效果极显著低于阳性药物辛伐他汀（P＜0.01）。对于培养基中胆固醇浓度，各组组间差异均极其显著（P＜0.01），且培养基中的总胆固醇含量随植物甾醇纳米粒浓度的增大而极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，浓度为50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1和400 μg·mL-1植物甾醇纳米粒组的培养基中总胆固醇含量分别升高了53.56%、73.64%、104.43%和125.69%（P＜0.01）。

图3 不同浓度的植物甾醇纳米粒对培养基和细胞内总胆固醇含量的影响

2.4 植物甾醇纳米粒对培养基中总胆汁酸含量的影响

不同浓度的植物甾醇纳米粒对培养基中总胆汁酸含量的预防效果如图4所示。模型组和各给药组培养基中总胆汁酸含量均低于正常组，但不存在显著差异（P＞0.05），且各组组间差异均不显著（P＞0.05），说明植物甾醇纳米粒对培养基中总胆汁酸含量没有显著的预防效果。

图4 不同浓度的植物甾醇纳米粒对培养基中总胆汁酸含量的影响

2.5 植物甾醇纳米粒对HepG2细胞内抗氧化指标的影响

不同浓度的植物甾醇纳米粒对细胞内SOD和CAT活力的影响如图5和6所示。模型组细胞内SOD和CAT活力分别降低了66.84%和58.67%，均极显著地低于正常组（P＜0.01）；经过不同浓度的植物甾醇纳米粒干预24 h后，细胞内SOD和CAT活力较模型组均极显著提高（P＜0.01），且随着植物甾醇纳米粒浓度的增大，其活力提高越明显；与模型组相比，4个浓度的植物甾醇纳米粒（50 μg·mL-1，100 μg·mL-1，200 μg·mL-1和400 μg·mL-1）干预下细胞SOD活力分别升高了25.11%、50.06%、87.53%和112.89%，分 别 比 正 常 组 低58.52%、50.24%、37.82%和29.41%；细胞CAT活力分别升高了20.66%、35.80%、62.87%和75.71%，分别较正常组低50.14%、43.88%、32.69%和27.39%，且各组之间均存在极显著的差异（P＜0.01）。说明植物甾醇纳米粒能够有效提高高胆固醇细胞内SOD和CAT的活力，且具有极显著的剂量效应，但效果低于比阳性药物辛伐他汀，在试验浓度范围内不能使SOD和CAT活力恢复至正常水平。

图5 不同浓度的植物甾醇纳米粒对细胞内SOD活力的影响

图6 不同浓度的植物甾醇纳米粒对细胞内CAT活力的影响

3 结论

本研究以人肝癌细胞株HepG2细胞为辅助研究对象，并用胆固醇诱导，构建高胆固醇细胞模型，再用不同浓度的植物甾醇纳米粒进行干预，观察不同剂量植物甾醇纳米粒对高胆固醇诱导的HepG2模型细胞的降胆固醇效果。植物甾醇纳米粒不具有细胞毒性，能显著降低细胞内胆固醇水平，且存在极显著（P＜0.01）的剂量效应；能够显著提高细胞内抗氧化指标SOD和CAT的活力，剂量效应显著（P＜0.01）。本研究为植物甾醇纳米粒的降胆固醇效果提供理论依据，为植物甾醇纳米粒作为膳食补充剂的应用提供了技术支持。