食品中呕吐毒素Cereulide特性及 检测方法研究进展

罗信旭，谢 珊

（贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳 550004）

1 Cereulide特性

Cereulide是由蜡样芽孢杆菌ces基因簇编码的产物，该基因簇位于蜡样芽孢杆菌质粒DNA上，主要包括7个编码区，其中cesA基因和cesB基因与Cereulide合成有关。Cereulide具有致吐作用，故称其为呕吐毒素。值得注意的是该呕吐毒素与人们常说的呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）是两种不同的物质，后者由镰刀菌产生。除蜡样芽孢杆菌能产生Cereulide外，耐冷型魏登施泰藤芽孢杆菌（Bacillus weihenstepha nensis）也能产生Cereulide。Cereulide是由[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]3组成的一种十二环状多肽，分子量1.2 kDa，不溶于水，脂溶性大，耐蛋白酶水解，对酸、碱不敏感，在121 ℃高温下维持30 min仍具有活性，一般的食品加工过程不能将其破坏，属于耐热型肠毒素，在活菌被消除的情况下仍存在食物中毒的风险。Cereulide是一种特异性K+载体，能将K+转入线粒体内，从而改变细胞内外K+浓度差，进而破坏线粒体的氧化还原能力，影响细胞的正常代谢。Cereulide的同分异构体有7种，分别为Isocereulide A～G[1]。其化学结构、相对分子量与缬氨霉素十分相似，但Cereulide与K+的亲和力更大，毒性更强。Cereulide会使肠道细胞上皮电阻变大，紧密连接蛋白claudin-4的表达量增加，从而改变肠道细胞的生物转化，使肠道丧失屏障功能[2]。

2 Cereulide影响因素

2.1 菌株类型

Cereulide的产量是由内在因素（菌株类型）和外在因素（环境因素）共同决定的。并非所有蜡样芽孢杆菌都能产生Cereulide，如ATCC 14579，该菌株不产生呕吐毒素，过去研究得出只有5%～6%的蜡样芽孢杆菌能产生[3]。最近大多数研究发现，蜡样芽孢杆菌携带Cereulide基因的范围已远高于5%～6%[4-5]。

2.2 环境因素

环境因素对Cereulide合成的影响很大，主要包括温度、环境pH、氧气、离子浓度和基质类型的影响。研究发现，产生Cereulide的蜡样芽孢杆菌的培养温度主要集中在12～45 ℃，低于12 ℃部分基质中仍能产生Cereulide，超过45 ℃不再产生。AGATA研究发现[6]，酸性条件下蜡样芽孢杆菌更容易产生Cereulide。杨佐毅等人[7]发现Cereulide的产生必须有氧气的参与，厌氧条件下不产毒。SHAHEEND等人[8]在研究婴幼儿配方奶粉中Cereulide产生情况时，发现当氧气浓度低于1.6%后，蜡样芽孢杆菌不再产生Cereulide。APETROAIE-CONSTANTIN等人[9]在研究离子浓度对Cereulide合成的影响时，发现低盐离子浓度更有利于Cereulide的产生。MESSELHAUSSER等人[10]发现富含维生素和微量元素的食物能促进Cereulide的产生。此外，培养基的状态也会影响Cereulide的产量[11]，固体培养基较液体培养基更容易产生。有学者就不同食物基质对蜡样芽孢杆菌的生长和Cereulide的产量影响进行研究，发现蜡样芽孢杆菌在谷物基质中产生的Cereulide明显高于培养基，在肉和蔬菜基质中产量最少[12]。以上学者对Cereulide合成影响的研究，对食品储存具有实际的指导意义，应尽量选择低温、真空条件保存食品。

3 Cereulide检测方法

关于呕吐毒素Cereulide的检测，主要有以下4种方法。

（1）动物试验法。该方法只能对Cereulide定性，得出的结果不准确，而且费用较高。

（2）生物检测法。属于半定量检测，目前有两种，分别是细胞空泡应答检验法和体外精子活力试验法。该方法对实验室的要求较高，一般实验室很难进行，不能大面积推广。

（3）PCR检测法。该方法能从基因层面上对产Cereulide的菌株进行快速检测，缺点在于该方法不能达到毒素定量检测目的。

（4）化学检测法。有高效液相色谱（HPLC）、飞行时间质谱（HPLC-ESI-TOF）[13]、高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）[14]、反向色谱（RPC）[15]等，其中HPLC-MS联用法被认为是Cereulide检测和定量的金标准，同时也使用得最多。该方法灵敏、准确，定量限为10 ng/kg，检出限为3 ng/kg。HPLC-MS联用法测定食品中Cereulide有外标法和内标法两种。除Cereulide外，人工合成的13C6-Cereulide和缬氨霉素均可作为内标物。研究发现选用13C6-Cereulide作为内标物，结果明显优于缬氨霉素。HPLC-MS联用法虽是Cereulide定量的金标准，但该方法所用设备均属于大型精密高端设备，众多实验室不具备该条件，因此，普及十分困难。为了克服以上难题，Kalbhenn等[15]研究者初次尝试运用RPC对Cereulide进行分离和定量，并运用HPLC-MS联用法对定量结果进行了验证，发现RPC能精确地对样品中的Cereulide进行分离定量。相对HPLC-MS联用法，RPC是一种更加经济、更加简便且常规实验室均可开展的检测手段。

4 结语

我国食品中蜡样芽孢杆菌的检测主要采用国家标准GB/T 4789.14—2014和进出口商品检验行业标准SN 0176—2003。该方法操作程序复杂，实验周期长，对致病菌的检测特异性不高且检出限较高，主要用于活菌数的定量，不适用于由Cereulide引起的食物中毒，无法有效保证食品安全。近年来，Cereulide引起的食物中毒时有发生，因此建立食品中Cereulide的快速检测方法和相应的标准十分有必要。