水生软体动物中氯霉素的测定

陈 磊

（马鞍山市市场监管综合行政执法支队，安徽马鞍山 243000）

氯霉素是一种广谱抗菌药物，由Ehrlichz在1947年首次分离得到[1]。氯霉素不仅对多数革兰氏阳（阴）性菌有很好的抑制作用，而且对沙门氏菌病和大肠杆菌病有很好的治疗作用，因此在疾病的预防和治疗方面得到了广泛的应用[2-3]。但随着广泛应用后发现，氯霉素可导致人类再生障碍性贫血、粒细胞缺乏病、灰婴综合症、溶血性贫血等，具有毒副作用[4-5]。当前许多国家在食品生产环节都禁止使用氯霉素，我国农业部于2019年颁布第250号公告《食品安全国家标准食品中兽药最大残留量》中规定氯霉素在动物源性食品中不得检出[6-7]。目前现行有效的氯霉素检测标准中样品处理的步骤烦琐，试剂耗材使用量大，因此本文提出一种高效、准确、环保的方法来检测氯霉素。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

AB 3500型液相色谱配备三重四级杆质谱仪（美国，SCIEX）；ME204/02型万分之一天平（瑞士，梅特勒-托利多）；Arium-Pro型纯水系统（德国，赛多利斯）；S-700B型多参数测试仪（瑞士，梅特勒-托利多）；T18型分散机（德国，IKA）；0.22 μmPTFE微孔滤膜（德国，CNW）；HC-3018型离心机（中国，中科中佳）；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美国，waters）；24位固相萃取装置（德国，CNW）；N-EVAP 5085型氮吹仪（美国，Organomation Associates）。

1.1.2 实验试剂

氯霉素、D5-氯霉素均由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供；乙腈（LC-MS级，默克）；甲酸（LC-MS级，TCI）；甲醇（LC-MS级，默克）；乙酸乙酯（色谱纯，TEDIA）；氨水（优级纯，国药）；柠檬酸（分析纯，阿拉丁）；磷酸氢二钠（分析纯，阿拉丁）；氢氧化钠（分析纯，国药）；乙二胺四乙酸二钠（分析纯，国药）；实验室用水均为超纯水。

1.1.3 试剂配制

①Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液。称取柠檬酸12.9 g，磷酸氢二钠10.9 g，乙二胺四乙酸二钠37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氢氧化钠调pH至4.0±0.5，加水定容至 1 000 mL。②氯霉素标准储备液（100 μg/mL）。准确称取0.01 g 的氯霉素标准物质，用乙腈配制成 100 μg/mL标准储备液。③氯霉素标准中间液（10 μg/mL）：移取1 mL 的氯霉素标准储备液，用乙腈配制成10 μg/mL标准储备液。④D5-氯霉素标准储备液（100 μg/mL）。准确称取0.01 g 的D5-氯霉素标准物质，用乙腈配制成100 μg/mL标准储备液。 ⑤D5-氯霉素标准中间液（1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素标准储备液，用乙腈配制成1 μg/mL标准储备液。 ⑥D5-氯霉素标准工作液（0.1 μg/mL）。移取1 mL 的D5-氯霉素标准中间液，用乙腈配制成0.1 μg/mL标准储备液。⑦氯霉素标准工作液。分别移取0.01 ml、0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL、 1.00 mL 的氯霉素中间液和1 mLD5-氯霉素标准工作液至 10 mL容量瓶中，并用初始流动相定容至刻度配制浓度为 0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL，的工作液，混匀。

1.2 色谱条件与质谱条件

1.2.1 色谱条件

月旭Ultimate C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；流动相：10 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B）；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱条件

电喷雾电离源（ESI）；负离子扫描，多反应监测（MRM）；离子源温度（TEM）：550 ℃；电喷雾电压：-4 500 V；气帘气：35 psi；喷雾气（GS1）：55 psi；辅助加热气（GS2）：55 psi；其他质谱条件见表2。

表2 氯霉素质谱参数优化条件

1.3 实验方法

称取2.0 （g精确至0.1 mg）置于50 mL离心管中加入100 μL， 20 mLNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，10 000 r/min匀浆提取1 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液以2 mL/min的速度过HLB固相萃取柱（使用前分别用6 mL甲醇和6 mL水活化），待试样完全流出后，依次用8 mL水和5 mL甲醇水溶液（甲醇∶水体积比为1∶19）淋洗，弃去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇洗脱，在40 ℃水浴下氮气吹至近干，用2 mL初始流动相复溶，过0.22 μmPTFE滤膜，待上机测试。氯霉素测试结果见图1。

图1 氯霉素标准MRM色谱图

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

本文分别选用乙腈-Mcllvaine、碱化乙酸乙酯以及Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取液，对氯霉素进行提取。发现这3种提取液对氯霉素的提取效率没有明显差异，为减少有机试剂的使用量，本文最终选择了Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液为提取液。

2.2 固相萃取柱的选择

HLB固相萃取柱中的填料是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，其对非极性至中等极性的酸性、中性、碱性目标化合物均有高而稳定的回收率。即使柱床干涸，回收率也不受影响。相同规格下HLB固相萃取柱的柱容量是传统C18固相萃取柱的3倍。因此选用HLB固相萃取柱进行样品 分析。

2.3 工作曲线和检出限

按照实验方法，对浓度分别为0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL标准系列溶液进行测定，以氯霉素的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果表明，氯霉素的质量浓度与其对应的峰面积之间呈线性关系。线性回归方程和相关系数见表3。将混标添加在空白基质样品中，在相同条件下进行6次平行试验，按照3倍信噪比考察了氯霉素的检出限（见表3）。

表3 线性参数和检出限

2.4 加标回收试验

分别称取4种水生软体动物阴性样品2.0 g（精确至 0.1 mg），按照实验方法对其进行不同浓度水平的加标回收试验，每个浓度平行进行6次实验，计算回收率，结果见表4。

表4 回收试验结果(n=6）

3 结论

本文建立了Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液为提取液，连用HLB固相萃取柱净化的方法对市售水生软体动物进行前处理，使用液相色谱联用三重四级杆质谱仪测定氯霉素。该方法操作简便、准确度高，经济适用型好，分离度符合要求，适合软体动物中氯霉素的定性和定量分析，为水生软体动物的市场监管提供了有力的技术支持。