食品中生物素检测方法概论

□ 华晶忠 吉林省经济管理干部学院 刘笑笑 魏春雁 吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

生物素即维生素B7，又称维生素H、辅酶R等，它是合成维生素C的必要物质，同时在脂肪合成、糖质新生等生化反应中扮演着重要角色，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。生物素能构成视沉细胞内感光物质，维持上皮组织结构完整和健全，增强机体免疫反应和抵抗力。婴儿若缺乏生物素会造成严重的神经症状，出现躁狂、嗜睡和发育迟缓，因此生物素也为婴幼儿配方食品必检项目。

到目前为止，美国AOAC以及我国国标GB 5009.259-2016《食品安全国家标准食品中生物素的测定》都将微生物法作为生物素检测的首选方法和仲裁方法。

国标微生物法维生素检测前处理复杂，操作步骤繁琐，确保数据准确主要应掌握以下几点。

1 玻璃器皿处理

国 标 GB 5009.259-2016 中 没 有提及试管等玻璃器皿的处理，但是在国 标 GB 5009.210-2016《 食 品 安 全国家标准食品中泛酸的测定》及GB 5009.89-2016《食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定》中都特别注明玻璃器皿的处理，可见玻璃器皿中残留的物质对实验结果的影响不小。建议所有玻璃器皿先用清水浸泡0.5 h后，用去污粉洗刷，流水冲洗3遍以上，再用去离子水润洗3遍以上，沥干后放入烘箱170 ℃干热3 h后使用。此外，生物素检测实验所有用品都要实验专用，不与其他实验混合使用。

2 菌株制备

试验前一天下午把活化好的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，第二天早上要密切注意菌株的生长情况，肉汤浑浊但尚未出现沉底的情况即可取出培养箱备用。

3 试样制备

样品处理时降温过程要迅速，避免颜色变化。样品稀释后的生物素浓度（一般可通过样品标签标示值获得）应尽量被标准溶液的系列梯度所覆盖，必要时多选几个稀释度。

4 标准系列管配置

配置标准系列管时，用来装水、装培养基和标液的瓶子以及相应的移液管都应专用，避免生物素交叉污染。配置标准系列管时，建议按照：添加水—添加培养基—盖上空白管的试管帽—添加标液和样品稀释液的操作顺序。

5 培养

配置完后所有试管应放入灭菌锅内，105 ℃灭菌5 min后取出迅速冷却，避免颜色变化。

向每支测试管接种调好浊度的菌悬液，标准中规定是接种一滴。试验证明一滴的菌悬液其实大小不一，很难保证向每支测定管中加入的菌量保持一致。所以，建议前面配置标准系列管时除了空白管加入5 mL测试培养基外，其余试管都加入4 mL培养基。灭菌后，将菌悬液加到剩余测试培养基中，混合后再向每根测试管加入1 mL混合菌液的培养基，这样更能保证加入相对等量菌量。

6 测定

所有试管培养16 h后，要注意观察菌生长情况，在空白接种管菌株生长的透光率不小于90%的情况下，直至标准系列管获得最大浑浊度。

7 结果分析

微生物的生长与待测试样中生物素含量呈线性关系，所以标准规定以标准系列管生物素含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据比较透光率与标准曲线，计算试样中生物素的含量。实验证明，微生物的生长过程中还会受到竞争与抑制作用，随着生物素浓度的增加，吸光度增长趋缓。标准曲线各个点并不是严格分布在直线上，因此通常情况下标准曲线相关系数大于0.95就可以接受。

8 结语

GB 5009.259-2016方法关键在于细节要做好，检测操作人员需要积累一定的经验。考虑到这些情况，标准中也规定可采用预先包埋了菌种的微生物法生物素试剂盒测定。试剂盒法在相同原理下对方法进行了改进，更加简便，将稀释的样品提取物和生物素检测培养基加入包埋了菌种的微孔中。孵育条件应为37 ℃黑暗条件下44 ～ 48 h。最后通过 ELISA reader在610～630 nm（或者540～50 nm）读取结果。所用玻璃器皿在使用前需用一定浓度盐酸漂洗，然后再用蒸馏水250 ℃条件下加热1 h以保证无化学残留物和微生物污染。样品的过滤、稀释与检测前的准备工作则与整个检测过程一样必须在无菌条件下进行，检测的每个步骤都需要校正，标准品和样品应该进行3次检测。