花生芽中6-苄基腺嘌呤的测定方法研究

建立了高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法。6-苄基腺嘌呤的检测波长为267nm；流动相为甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v）；前处理的提取方式为超声波提取法；高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范围线性良好，相关系数为0.9998，检出限为0.1mg/kg，精密度为1.82%，用该方法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。

6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)分子式是C12H11N5，分子量为225.25，熔点：230℃，形状为白色晶体，难溶于水，微溶于乙醇等有机溶剂，易溶于酸和碱且性质稳定。6-苄基腺嘌呤是一种人工合成的细胞分裂素，主要用于促进细胞分裂、细胞增大、种子发芽和果实生长等，我国曾经允许在豆芽生产上的应用。6-苄基腺嘌呤作为植物生长调节剂，其安全性目前没有结论，并且缺乏食品添加剂工艺必要性，目前我国的标准GB2760已经禁止6-苄基腺嘌呤作为食品用加工助剂生产经营和使用。

6-苄基腺嘌呤更多的报道是关于在豆芽生产中的应用，俗称的“无根粉”主要成分就是6-苄基腺嘌呤，对于花生芽不管是生产方面或者是检测方面报道较少。花生芽被认为一种食疗兼备的食品，营养丰富，并富含维生素及各种氨基酸和微量元素，花生芽的生产和销售越来越普遍，对花生芽的各项指标的检测方法有研究的意义。

6-苄基腺嘌呤的检测方法主要是光谱法和色谱法，光谱法灵敏度不够，基质干扰大，色谱法具有准确、高效、快速的特点。本论文研究高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法，为花生芽中6-苄基腺嘌呤的检测提供技术参数。

材料与方法

仪器及材料 高效液相色谱仪：LC20AD（日本岛津公司）；色谱柱：C18柱(250mm×4.6μm，美国waters公司)；电子分析天平（日本岛津公司）；微波炉（美的公司）；离心机（sigma公司）；超纯水系统（德国Millipore公司）；刀片式均质器（德国ⅠKA公司）；超声波提取器（上海比朗）。

6-苄基腺嘌呤标准品纯度均大于99%（德国Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色谱纯，美国CNW公司）；乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

仪器条件 流动相：甲醇：20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v），等度洗脱。流速：1.0mL/min；色谱柱温度：40℃；检测器：二极管阵列检测器，波长267nm；进样量：20μL。

结果与讨论

检测波长的确定 二极管阵列检测器能从190nm到900nm的全波段检测，要检测6-苄基腺嘌呤首先要确定其检测波长。配制6-苄基腺嘌呤的标准溶液，浓度为10.0mg/L，上机测定，从测定结果的光谱色谱三维图发现在5.8分钟有明显的响应，提取该时间点的吸收光谱图，结果见图1。

图1 6-苄基腺嘌呤的吸收光谱图

图1 中发现在210nm及267nm处均有吸收顶点，210nm处受到的干扰较大，因此选择267nm为6-苄基腺嘌呤的检测波长。

流动相的选择 选择纯甲醇、甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v）和甲醇-水（50∶50，v/v）三种不同体系的流动相作比较，流速均为为1.0mL/min，进样浓度为1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤标准溶液，结果见图2。

图2 不同甲醇比例作为流动相的峰面积变化图

从图2中，1号为纯甲醇流动相的色谱图，峰形不对称，出峰时间过早有可能与其他杂质重合或者分离不好；3号为甲醇-水（50∶50，v/v）流动相的色谱图，峰形对称但是峰展宽较大；2号为甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v）流动相的色谱图，峰形对称并且峰展宽小，乙酸铵在流动相中有改善峰形的作用，因此选择甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v）作为测定6-苄基腺嘌呤的流动相。

样品前处理 用甲醇提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤，比较几种不同的提取方式，花生芽直接称样20.0g置于100mL的离心管中，加入50mL甲醇，用刀片式均质器均质2分钟。超声波提取：用超声波提取器提取30min；浸泡提取：在室温下放置10小时；微波提取：微波提取2分钟；各方法提取结束后冷却，5000r/min离心10分钟，取上层溶液过0.45μm滤膜，上机测定，结果见表1。表中微波提取法虽然用时少，但是结果偏低，可能的原因是提取时间不足或者是6-苄基腺嘌呤分解了，超声波提取效率高，因此选择超声波提取法提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤。

表1 花生芽加标提取6-苄基腺嘌呤结果

方法学验证 线性关系及检出限 配制6-苄基腺嘌呤的系列标准溶液，上机测定，高效液相色谱法6-苄基腺嘌呤在1-50mg/L的范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9998，以基线噪声的三倍作为测定的检出限，6-苄基腺嘌呤的检出限为0.1mg/kg。

表2 6-苄基腺嘌呤线性及检出限

精密度及回收率 进样10.0mg/L的6-苄基腺嘌呤标准溶液，连续进样11次计算精密度，结果见表4，高效液相色谱法测定6-苄基腺嘌呤的精密度为1.82%，精密度符合测定的要求。

表3 6-苄基腺嘌呤精密度

取花生芽样品，称样20.0g，添加6-苄基腺嘌呤标准溶液作为回收率的测试，按照3.3的前处理方法处理花生芽样品，回收率实验结果见表4。高效液相色谱法测定6-苄基腺嘌呤的回收率在90%以上，满足分析要求。

表4 6-苄基腺嘌呤的回收率

建立了高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法。通过提纯光谱，确定选择267nm为6-苄基腺嘌呤的检测波长；通过比较，选择甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液（50∶50，v/v）作为检测6-苄基腺嘌呤的流动相，流动加入乙酸铵能够很好地改善峰形；研究了前处理的提取方式，选择超声波提取法提取花生芽中的6-苄基腺嘌呤；对方法进行验证，高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的在1-50mg/L范围线性良好，相关系数为0.9998，检出限为0.1mg/kg，精密度为1.82%，用该方法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的回收率在90%以上。高效液相色谱法测定花生芽中6-苄基腺嘌呤含量的方法准确，高效，可满足检测技术要求。

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