多重PCR法在食品中致泻大肠埃希氏菌质控考核中的应用

1.引言

大肠埃希氏菌俗称大肠杆菌，是人类和动物的肠道中重要的正常菌群，为宿主提供一些有营养作用的合成代谢产物。多数大肠埃希氏菌并不致病，当机体抵抗力下降或侵入肠外组织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外的感染，引起胃肠炎的大肠埃希氏菌分为五类即肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、肠产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(EⅠEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和粘附性肠埃希氏菌(EAEC)[1]。快速检测和鉴定病原菌是及时有效地控制与预防传染病传播的重要手段。传统的微生物学分离与鉴定以及血清学方法在鉴别与鉴定病原微生物方面日益显现出不足。PCR法快速、敏感、特异，是对病原菌快速鉴别与分型的重要技术之一，而多重PCR更以其突出的优越性得到了广泛的应用[2]。

2.材料与方法

2.1 样品

样品编号为15-1, 15-2，每份考核样品包含西林瓶1个，西林瓶中装有白色冻干菌球。本次考核共计2份样品。

2.2 试剂及仪器

营养肉汤、肠道菌增菌肉汤、麦康凯琼脂(MAC)、伊红美蓝琼脂(EMB)、三糖铁(TSⅠ)琼脂、大肠埃希氏菌生化套盒、无菌双蒸水，以上试剂均使用北京路桥。五种致泻大肠埃希氏菌DNA提取试剂盒、多重PCR及实时荧光PCR试剂盒均使用北京卓诚惠生，实时定量PCR仪器（BⅠO-RAD公司），凝胶成像仪（BⅠO-RAD公司），电泳仪。

2.3 试验方法

按照GB4789.6-2016《食品安全国家标准 食品微生物学 致泻大肠埃希氏菌检验》[2]开始检测。

2.3.1 样品前处理与预增菌

待质控样品恢复至室温，无菌开启瓶盖，将西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL无菌生理盐水中,作为样本。

2.3.2 以无菌操作量取检样25mL，加入装有225mL营养肉汤的无菌袋中，振荡混匀。将营养肉汤增菌液放置于36℃培养18h（增菌时间延长）。取1mL（加样量增大）,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内，于42℃培养18h。

2.3.3 分离

将增菌液划线接种MAC和EMB琼脂平板，于36℃培养24h，观察菌落特征。

2.3.4 生化鉴定

选取平板上10个可疑菌落,分别接种TSⅠ斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、尿素琼脂(pH7.2)、KCN肉汤和营养琼脂平板，于36℃培养24h。

2.3.5 PCR确证试验

使用1μL接种环刮取营养琼脂平板上的菌落，悬浮于200μL灭菌双蒸水中，充分打散制成菌悬液，13000r/min离心3min，弃掉上清液。加入50μL充分震荡混匀的核酸提取液，于100℃金属浴维持10min，13000r/min离心3min，收集上清液，取2μL作为PCR检测的模板。

3.结果与分析

3.1 平板分离结果结果如下

编号 麦康凯（MAC）培养基 伊红美蓝（EMB）15-1 桃红色、湿润、圆形菌落；淡粉色、湿润、圆形菌落中心紫黑色带金属光泽;部分中心紫黑色不带金属光泽15-2 桃红色、湿润、圆形菌落；淡粉色、湿润、圆形菌落中心紫黑色带金属光泽;部分中心紫黑色不带金属光泽

3.2 可疑菌落生化鉴定结果如下

注：“-”表示无生长，“+”表示生长。10个可疑菌落生化结果相同。

3.3 可疑菌落PCR确证试验结果如下

注：“-”表示无条带或曲线，“+”表示有条带或曲线。

4.讨论与分析

本实验室自2014起，参与国家食品风险监测项目，并开始使用多重PCR技术，对五种致泻大肠埃希氏菌进行检测。GB4789.6-2016自2017年6月23日执行以来，也是食品微生物学检验系列国标中，首个细菌使用PCR做确证的标准。河南省疾病预防控制中心对全省各地市进行了质控考核，了解各实验室对该技术掌握的程度以及实验室检测水平。

传统的血清学分型，操作繁琐，技术人员要求高，且检验结果并不能作为是否有致病能力的依据，只能说某个血清型可能与致病相关。血清学鉴定的137株致泻大肠中仅有15株（10.9%）为正确鉴定，仅采用血清学分类是不够的[3]。与传统血清试验相比较而言，用PCR方法进行确证，操作简单，对操作人员要求不高，且提高致病菌检出率及检验的准确性，同时缩短了致病菌的检验时间。随着快速检验方法的发展，快速检验因其优点快速发展，在突发公共卫生事件的处理中，发挥积极作用，但快速方法也存在其缺点，快速检验一般从基因着手，检测到致病菌并未获得其菌株，容易产生假阳性结果。因此，在面对突发公共卫生事件时，应该灵活运用，将快检方法与传统方法相结合，快速准确地得出实验室结果，为相关部门处理问题提供可靠依据。该实验室在此质控过程中使用了两种多重PCR方法来进行确证试验，相互印证结果，两种方法实验结果一致。实时荧光多重PCR优点在于将PCR扩增与结果判定结合一起，操作简单，耗时短，污染少。普通PCR试验后，需要进行电泳试验并用凝胶成像仪观察结果，操作繁琐，试验过程耗时长，存在污染环境风险[4]。

[1] 李凡, 刘晶星. 医学微生物学(第七版)[M]. 北京∶人民卫生出版社, 2012.

[2] 世界卫生组织. 麻疹实况报道. 2017－03.

[3] GB4789.6-2016《食品安全国家标准 食品微生物学 致泻大肠埃希氏菌菌检验》[s].

[4] J Yang ,FJWu, J Mu,L Lin ,et al.Comparison between O Serotyping Method and Multiplex Real-Time PCR To Ⅰdentify Diarrheagenic Escherichia coli inTaiWan [J].《Journal of Clinical Microbiology》, 2007, 45(11) ∶3620-3625