红枣果醋醋酸菌株的分离鉴定

□ 林祥群 新疆石河子职业技术学院 刘文玉 石河子大学 颜雪琴 新疆石河子职业技术学院 魏长庆 石河子大学

红枣果醋醋酸菌株的分离鉴定

□ 林祥群 新疆石河子职业技术学院 刘文玉 石河子大学 颜雪琴 新疆石河子职业技术学院 魏长庆 石河子大学

果醋作为一种新型保健饮料，因其营养丰富、风味独特、口感俱佳而备受广大消费者的欢迎。红枣果醋就是以红枣为主要原料，经酒精和醋酸发酵而成，既可作为调味品，又可作为饮料直接饮用。该文从红枣的营养、加工现状等方面综述红枣果醋的研究进展，说明红枣果醋的开发具有广阔的前景。

红枣；营养成分；果醋；研究进展

1 采样说明

本研究以石河子市150团红枣产区为主要采样地点，采集样品包括红枣种植园的土样、红枣树叶以及新鲜红枣，用富集培养法和平板筛选法进行菌株的初筛，从中筛选出11株醋酸菌，摇瓶发酵法复筛，在复筛过程研究其发酵产酸能力，确定工作菌株L-9，然后对工作菌株的生长特性和生理生化特点研究，对菌株进行鉴定，为优质红枣果醋的发酵打下良好的菌种基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 采样原料

原料：红枣果园土壤、红枣果树树叶、市场购买的鲜枣（放置软烂）。

对照菌株为ASI.41（A.rancens L.），本文中简写为A，来自石河子大学食品学院食品生物技术实验室。

2.1.2 培养基

（1）初筛培养基：酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO31%、琼脂1.5%，灭菌后加无水乙醇6%（v/v），自然pH值。

（2）复筛培养基：葡萄糖1%、酵母膏l%，灭菌后加入无水乙醇6%，自然pH值。

试管培养基：酵母膏1%、葡萄糖1%、CaCO30.5%、琼脂2.0%、无水乙醇3%（v/v），自然pH值。

2.1.3 主要试剂

氢氧化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、氧化钙、3,5-二硝基水杨酸、硝酸钠，以上试剂均为分析纯。

2.1.4 主要仪器设备

分光光度计、离心机、高压灭菌锅、恒温水浴槽、显微镜、电子天平、恒温恒湿摇床及酸度计等。

2 2 方法

2.2.1 菌源制备及富集培养

原料1：市购1 kg新鲜红枣，放置自然软烂，置于500 ml三角瓶中，用四层纱布封口，自然酒精发酵。用手持糖度仪测其糖度，当糖度降到4°BX，对原料打浆涂布平板初筛培养基分离菌株。

从石河子醋厂采取的醋醅2 g，放入有50 mL蒸馏水的250 mL三角瓶中，30℃摇培3 d后进行菌株筛选。

原料2：150团红枣种植园采集土壤，混和于无菌蒸馏水，涂布平板初筛培养基分离菌株。

原料3：150团红枣种植园采集红枣树叶，将树叶用无菌手术刀剪切，放置于涂布平板初筛培养基分离菌株。

2.2.2 挑选醋酸菌

将稀释涂布生长72 h的菌株中形态与醋酸菌相似的菌落接种于复筛培养基中，30 ℃培养72 h，吸取1 mL培养液于平板培养基，涂布分离，30 ℃培养72 h，选择透明圈大的单菌落接种于斜面培养基保存。

2.2.3 醋酸菌定性试验

将筛选出的菌株接种于摇瓶培养基中，摇床30 ℃培养72 h后，培养液以15 min、4 500 r/min的转速离心除去菌体，吸取5 mL上清夜，以0.1 mol/L氢氧化钠中和至pH 7.0，将中和液煮沸，加入0.1 mol/L氯化铁溶液5滴，有红褐色沉淀产生者为产醋酸菌。

2.2.4 醋酸菌定量试验

将筛选出的醋酸菌分别接种于醋酸菌三角瓶培养基中，摇床30 ℃培养3 d后，采用碱式滴定法（以醋酸计）测其产酸量，从中筛选产酸量高的菌株进行复筛。

滴定时，取2 mL发酵液于250 mL的三角瓶内，加入50 mL蒸馏水，3～5滴0.5%的酚酞酒溶液，用标定的0.IN的氢氧化钠溶液滴至浅粉红色，由耗用的氢氧化钠溶液的体积计算样品中的含酸量，每个处理均以3个平行样的平均结果计算，选择产酸量大的。

2.2.5 醋酸菌鉴定分类方法

菌落形态观察：在平板培养基上用划线分离方法培养细菌，20 ℃培养24 h，肉眼观察单菌落形态。

菌体形态观察：涂片固定培养至对数期的细胞，革兰氏染色，镜检。

培养特征观察：液体培养基培养48 h，观察。

表1 醋酸菌定量试验结果（单位：g/L）

表2 产酯试验结果（单位：g/L）

3 试验结果与分析

3.1 菌株分离纯化

从软烂红枣中筛选出16株菌，对其编号为H1-16；从果园土壤中筛选出5株菌，编号为T1-5；从红枣果树树叶中筛选出3株菌，对其编号为S1-3。

3.2 醋酸菌定性试验

对筛选出的24株菌进行醋酸菌定性试验，发现有11株菌株为醋酸菌。

3.3 醋酸菌定量试验

对筛选的11株菌和对照菌株ASI.41（A.rancens L.）进行产酸量试验。结果见表1。

由表1可以看出菌株H2、H5、H9、H11的产酸量均大于对照菌株A，故选择H2、H5、H9、H11四株菌株进行醋酸菌产酯试验。

3.4 醋酸菌产酯试验

对H2、H5、H9、H11进行产酯试验。试验结果见表2。

由表2可知菌株H9的产酯量与对照A的产酯量相差不大，所以选H9作为工作菌株，进行下一步研究。

3.5 醋酸菌鉴定分类

H9在固体培养基上菌落表面光滑，呈圆形，有凸起，菌落周围有明显的碳酸钙溶解圈；液体培养基中培养基变浑浊，有明显的醋酸味。革兰氏染色阴性，无芽孢，菌体短杆状，单个或成对、成链排列。

4 结论

本试验从软烂的红枣、红枣园土壤、红枣树树叶中筛选出醋酸菌株24株，并对它们进行醋酸菌定性试验，筛选出产醋酸菌11株，对所筛的21株醋酸菌进行醋酸菌定量试验、产酯试验，选取菌株H9作为工作菌株，对H9进行培养特征、形态特征研究，初步鉴定H9为醋酸杆菌属（Pasteurianus-Acetobacter）巴氏醋酸杆菌。

魏长庆。