HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫分析检测马铃薯重花叶病毒

□ 刘海英 乌兰察布职业学院 俎爱忠 乌兰察布市产品质量计量检测所 陈建保 乌兰察布职业学院 张 浩 乌兰察布市产品质量计量检测所 康 俊 乌兰察布职业学院 景思远 乌兰察布市产品质量计量检测所

HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫分析检测马铃薯重花叶病毒

□ 刘海英 乌兰察布职业学院 俎爱忠 乌兰察布市产品质量计量检测所 陈建保 乌兰察布职业学院 张 浩 乌兰察布市产品质量计量检测所 康 俊 乌兰察布职业学院 景思远 乌兰察布市产品质量计量检测所

基于酶联免疫分析法，利用生物标记物辣根过氧化物（HRP）标记马铃薯重花叶病毒抗原，结合H2O2–邻苯二胺催化氧化反应体系，建立了一种高灵敏度的HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫分析检测马铃薯重花叶病毒方法。结果表明：该酶联免疫传感器对马铃薯重花叶病毒检测的动态响应为0.000 1～0.5 μg/mL，检测限为0.030 ng/mL（S/N=3），定量限为0.100 ng/mL（S/N=10），回收率在86.8%～101.6%，相对标准偏差（RSD）在1.3%～2.4%；其他马铃薯病毒对该传感器的干扰较小，表现出良好选择特异性。该方法简便、灵敏、选择性高，可为马铃薯重花叶病毒检测提供新途径。

辣根过氧化物酶；化学发光；酶联免疫；马铃薯；重花叶病毒

马铃薯病毒病是马铃薯生产过程中常见的病害，而被病毒侵染后的马铃薯会种性退化，导致减产或品质下降等问题，其危害已成为制约马铃薯生产的关键因素。据报道，可侵染马铃薯的病毒有20余种[1]，在我国传播范围大、侵染力度强的病毒包括马铃薯普通花叶病毒（PVX）、马铃薯重花叶病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯A病毒（PVA）等[2]。马铃薯生产中病毒病一旦发生，没有很好的防治办法。因此，寻找一种有效的病毒检测方法对控制该病毒至关重要。

目前，关于马铃薯病毒检测方法主要有指示植物法、分子生物学和免疫学方法。其中，指示植物法检测准确、直观、易于操作，但耗时长，现已不能适应生产需要；分子生物学检测技术具有灵敏、快速、特异性强等优点，但容易出现假阳性、检测费用较高；而免疫学检测手段对操作人员水平要求低、检测速度快、灵敏高和适用批量检测等优点，是目前马铃薯病毒筛查的主要检测手段，尤其是辣根过氧化物（HRP）基型酶联免疫分析法为新型分析方法[2]。本文利用HRP作为生物标记物可标记在病毒抗原的表面，再利用其对H2O2–邻苯二胺（OPDA）体系的催化氧化行为，建立了一种高灵敏度的HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫分析检测马铃薯重花叶病毒方法，该法具有操作简单、检出限低、精密度高等特点。

1 材料与方法

1.1 仪器

MPI-A型多功能化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）、F-4600型荧光分光光度计（日立高新技术公司）、ME204型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）、GSP-9160MBE型电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司）、96孔单条可拆化学发光酶标板（生工生物工程（上海）股份有限公司）和Bio_rad 550型酶标仪（伯乐生命医学产品（上海）有限公司）。1.2 试剂

过氧化草酸酯（TCPO），3-(4-羟苯基)丙酸（PHPPA）购买于百灵威（美国）。胎牛血清（FBS）来自Hyclone（美国）。3,3′,5,5′－四甲基联苯胺（TMB）、吐温-20、过氧化尿（CH4N2O•H2O2）和辣根过氧化物酶（HRP），均采购于Sigma公司。咪唑，购自武汉康隆世纪科技发展有限公司。乙醇、乙腈、乙醇、H2O2、NaCl、KCl、Na2B4O7·10H2O、Na-2CO3、CH3COONa、NaHCO3、KH-2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、H3BO3、C6H4(COO)2HK、NaH-2PO4·2H2O、C6H8O7·H2O 和三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（Tris），均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。1.3 酶催化

取96孔微型酶标仪板，每孔中定量加入 25 μg/mL 抗体 20 μL，37 ℃孵育0.5 h，使用PBST溶液洗去酶标仪板未键合的抗体；每孔加入0.1% BSA 80 μL进行封闭，37 ℃孵育30 min后，PBST溶液洗去未键合的BSA。每孔加入50 μL一定浓度的马铃薯重花叶病毒（PVY），37 ℃孵育30 min，PBST溶液洗去未键合的马铃薯重花叶病毒（PVY），然后酶标仪板每孔中加入0.5 mg/mL HRP 10 μL，室温静止吸附30 min，使用PBST溶液洗去酶标仪板上未键合的HRP，晾干备用。

1.4 光化学反应

将过氧化尿和PHPPA混合使其终浓度为5.0 mmol/L，加入到96孔微型酶标仪板中，每孔50 μL，涡旋混匀，37 ℃孵育10 min，标记的HRP分子与H2O2–OPDA体系发生催化氧化，使其发生显色反应，呈现出颜色变化和荧光反应，再利用荧光分光光度计测定其检测荧光强度，从而测定马铃薯重花叶病毒含量。具体实验流程见图1。

2 结果与讨论

2.1 酶联免疫光化学传感器原理

从图1中可知，本文建立的HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫检测马铃薯重花叶病毒方法是基于H2O2–邻苯二胺（OPDA）体系的催化氧化行为，利用HRP作为生物标记物可标记在马铃薯重花叶病毒抗原的表面，且HRP能增大H2O2–OPDA体系的显色反应和荧光效应，具有较高的选择特异性和灵敏度。

2.2 pH值对HRP酶催化反应的影响

在HRP酶催化反应中，缓冲溶液的pH值对HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫检测马铃薯重花叶病毒影响较大，尤其是磷酸盐缓冲溶液影响H2O2–邻苯二胺（OPDA）体系的催化氧化反应，当磷酸盐缓冲溶液pH在4.0～6.0时，随着缓冲溶液pH值的增大，生产的荧光强度逐渐增加；当pH值为6.0时，荧光强度最大；当pH在6.0～11.0时，荧光强度随着pH增加而减少。因此，为了获得较高的荧光强度和稳定性，酶催化反应pH值应选择pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液。

2.3 孵育温度和孵育时间对HRP酶催化反应的影响

考察了不同的孵育时间和孵育温度对HRP酶催化反应的影响。研究发现：当孵育温度为37 ℃时，HRP酶催化反应效果最佳；但当温度高于37 ℃或低于37 ℃时，HRP酶催化反应效果不佳，且HRP催化H2O2–OPDA体系的显色反应和荧光效应较差，荧光强度较低。当以孵育温度为37 ℃时，随着孵育时间的增加，荧光强度逐渐增大；当孵育时间为30 min，荧光强度最大；当孵育时间超过30 min后，荧光强度呈现渐弱趋势。因此，选择孵育温度为37 ℃，孵育时间选择10 min。

图1 实验流程图

2.4 溶剂对HRP酶催化反应的影响

考察了甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯和四氢呋喃等不同有机溶剂对HRP酶催化反应的影响。试验结果表明，马铃薯重花叶病毒在非极性溶剂中溶解度较小，HRP催化H2O2–OPDA体系的显色反应和荧光效应较差。但当反应体系中有水存在时，显色反应和荧光效应较强，尤其是当使用体积比为90%的乙腈作为溶剂时，显色反应和荧光效应最强。

2.5 标准曲线

取马铃薯重花叶病毒空白样品，按照1.3节和1.4节操作步骤，建立马铃薯重花叶病毒标准曲线。试验结果表明：在 0.000 1～ 0.5 μg/mL，马铃薯重花叶病毒含量与荧光去昂度呈线性关系，线性回归方程为y=3 506.1x+320.4，相关系数r为0.999 1，这表明该曲线线性关系良好；根据3倍信噪比计算马铃薯重花叶病毒方法检出限（S/N=3）为0.030 ng/mL；根据10倍信噪比计算马铃薯重花叶病毒方法定量限（S/N=10）为0.100 ng/mL，满足马铃薯重花叶病毒的检测要求。

2.6 精密度和回收率

采用马铃薯重花叶病毒空白样品，进 行 0.100、250.0、500.0 ng/mL三 种浓度加标回收率和精密度试验，按照上述所建方法进行测定，每个浓度重复6次。结果表明：加标回收率在86.8%～101.6%，相对标准偏差（RSD）在1.3%～2.4%，这说明该方法符合方法学的要求，且准确度高、精密度好。2.7 实际样品分析

采集市售马铃薯30份，按照本文所建方法进行检测，结果表明：30份测试样中，均未检出马铃薯重花叶病毒，这表明所抽检30份马铃薯样品质量较好。

3 结论

基于酶联免疫分析法，利用生物标记物辣根过氧化物（HRP）标记马铃薯重花叶病毒抗原，结合H2O2–邻苯二胺催化氧化反应体系，建立了一种高灵敏度的HRP-H2O2-OPDA化学发光酶联免疫分析检测马铃薯重花叶病毒方法。结果表明：该酶联免疫传感器对马铃薯重花叶病毒检测的动态响应范围为0.0001～0.5 μg/mL，检测限为0.030 ng/mL（S/N=3），定量限为0.100 ng/mL（S/N=10），回收率在86.8%～101.6%，相对标准偏差（RSD）在1.3%～2.4%；其他马铃薯病毒对该传感器的干扰较小，表现出良好选择特异性。该方法简便、灵敏、选择性高，可为马铃薯重花叶病毒检测提供新途径。

[1]董代幸.乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2010.

[2]吴兴泉,时妍,杨庆东,等.我国马铃薯病毒的种类及脱毒种薯生产过程中病毒的检测[J].中国马铃薯,2011(6):363-366.

内蒙古质监系统科研项目（编号：2015006）。

刘海英（1975—），女，