啤酒有害菌检验培养基的优化

□ 常立娟　青海省产品质量监督检验所

啤酒有害菌检验培养基的优化

□ 常立娟青海省产品质量监督检验所

现阶段，我国啤酒厂主要利用培养基检测技术检测啤酒有害菌，该技术投资少、便于观察且简单易行，在啤酒厂中广泛使用。但该技术所使用的N BB培养基、M RS培养基均依靠进口，这与我国啤酒大国的地位不相匹配。同时，我国啤酒较淡爽、麦汁浓度低，不可避免地导致我国啤酒有害菌与国外啤酒存在一定差异，对有害菌检验培养基的要求也略有不同。在积极构建和谐社会的今天，探究啤酒有害菌检验培养基的优化策略，具有重要现实意义。

试验部分

仪器与试剂

仪器：英国O XO ID公司生产的厌氧产气袋、厌氧指示片；生化培养箱；显微镜；厌氧罐；pH计等。

试剂：英国O XO ID公司生产的M RS培养基；德国企业生产的N BB培养基；中国食品发酵研究院提供的麦根浸出物；北京索莱宝企业提供的叶酸和精氨酸；受到污染的啤酒。

试验方法

1 配制培养基

严格按照说明书方法配制M RS培养基和N BB培养基。

2 菌种分离与培养

随机选取某厂生产的受到污染的啤酒，将酒样涂布到培养基上，选择单菌落，划线分离纯化得到2株乳酸杆菌。稀释被污染的酒样，并将其涂布到培养基上，在28 ℃的厌氧罐中培养5 d。

3 培养基成分的完善

通过单因素试验方法，以叶酸、精氨酸、麦根浸出物的优化为因素水平。水平①：麦根浸出物加量为10 m g/L，精氨酸为0.5 g/L，叶酸为20 m L/L。水平②：麦根浸出物加量为20 m g/L，精氨酸为0.8 g/L，叶酸为60 m L/L。水平③：麦根浸出物加量为30 m g/L，精氨酸为1 g/L，叶酸为100 m L/L。水平④：麦根浸出物加量为40 m g/L，精氨酸为1.3 g/L，叶酸为140 m L/L。水平⑤：麦根浸出物加量为50 m g/L，精氨酸为1.5 g/L，叶酸为180 m L/L。

4 培养基成分用量的优化

选择正交试验的方法优化麦根浸出物、精氨酸和叶酸的添加量。在M RS培养基用量的优化中，水平①：麦根浸出物加量为20 m g/L，精氨酸为0.5 g/L，叶酸为140 m L/L。水平②：麦根浸出物加量为30 m g/L，精氨酸为0.8 g/L，叶酸为180 m L/L。水平③：麦根浸出物加量为40 m g/L，精氨酸为1 g/L，叶酸为220 m L/L。在N BB培养基用量的优化中，水平①：麦根浸出物加量为20 m g/L，精氨酸为0.5 g/L，叶酸为60 m l/L。水平②：麦根浸出物加量

为30 m g/L，精氨酸为0.8 g/L，叶酸为100 m L/L。水平③：麦根浸出物加量为40 m g/L，精氨酸为1 g/L，叶酸为140 m L/L。

检出方法

表1　MRS培养基生长因子优化正交试验

表2　NBB培养基生长因子优化正交试验

通过革兰染色检测，革兰阳性菌为紫色，革兰阴性菌为红色。通过过氧化氢酶试验检测，有气泡则为过氧化氢酶阳性，无气泡则为过氧化氢酶阴性。通过显微镜观测，结合显微镜观察与上述检测结果，判定有害菌种类。

结果与讨论

培养基成分的完善

按照1.2.3设计的因素水平进行培养基单因素试验，培养5 d。结果表明，不同剂量的麦根浸出物均出现2种菌落，30 m g/L水平时，菌落最多、杆菌长势最好，10m g/L时，菌落最少。0.8 g/L精氨酸水平时，菌落最多。180 m g/L叶酸水平菌落最多、效果最好。综上可知，30 m g/L麦根浸出物+0.8 m g/L精氨酸+180 m g/L叶酸为M RS培养基最佳添加量。不同剂量的麦根浸出物均出现1种菌落，30 m g/L水平时，菌落最多、杆菌长势最好。0.8 g/L精氨酸水平时，菌落最多。180 m g/L水平的叶酸菌落最多、效果最好。综上可知，30 m g/L麦根浸出物+0.8 m g/L精氨酸+180 m g/L叶酸为N BB培养基最佳添加量。两者优化结果相同。

培养基成分用量的完善

按照1.2.4的因素水平进行正交设计，分别优化M RS培养基、N BB培养基中麦根浸出物、精氨酸以及叶酸的添加量。结果显示，在M RS培养基中，精氨酸影响最大、叶酸其次、麦根浸出物最小。提示与麦根浸出物、叶酸相比，精氨酸更易于促进有害菌生长。虽然麦根浸出物均会促进有害菌生长，但不如另外两种因素影响大，20 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L叶酸组合最佳。在N BB培养基中，精氨酸影响最大、叶酸、麦根浸出物影响相当。该研究再一次证实精氨酸对有害菌生长的促进作用。叶酸和麦根浸出物两者也对有害菌生长起到促进作用。其中，50 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L叶酸组合最佳。

验证试验

结合上述结果得出的两种最佳组合方式，分别以全新培养基为对照组，培养5 d后进行菌落总数验证试验。①M RS培养基中，20 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L叶酸组合方式形成菌落总数为1.7×103CFU/m L，对照组中1.4×103CFU/m L，经优化的培养基中的菌落总数明显要多。M RS培养基优化结果为：20 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L叶酸。具体情况见表1。②N BB培养基中，50m g/L麦根浸出物+0.8g/L精氨酸+140m g/L叶酸组合方式形成菌落总数为5.9×102CFU/m L，对照组中4.3×102CFU/m L，经优化的培养基中的菌落总数明显要多。N BB培养基优化结果为：50 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L叶酸。具体情况见表2。

结语

如果在M RS培养基中单独添加三种物质，麦根浸出物的最佳添加量为30 m g/L，精氨酸的最佳添加量为0.8 g/L，叶酸的最佳添加量为180 m g/L。如果在N BB培养基中单独添加三种物质，麦根浸出物的最佳添加量为30 m g/L，精氨酸的最佳添加量为0.8 g/ L，叶酸的最佳添加量为100 m g/L。三种营养因子优化配比试验中，M RS培养基优化结果为20 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L叶酸。N BB培养基优化结果为50 m g/L麦根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L叶酸。与N BB培养基相比，M RS培养基对乳酸杆菌的选择性更强，且检测能力更佳，M RS培养基更适合有害菌检测。精氨酸能极大促进乳酸杆菌等啤酒有害菌的生长，能有效促进有害菌生长繁殖，这为今后的有害菌检测研究指明方向。