HLB固相净化

王晓燕 诺安实力可（宁波公司）

摘 要：本文建立了奶粉中头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢匹罗、头孢洛宁残留量检测的HLB固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱方法。奶粉经乙腈-水提取，正己烷除脂，经HLB固相柱净化后供超高效液相色谱串联质谱仪检测。奶粉中头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢洛宁的检出限为10μg/kg，定量限为20μg/kg，头孢喹肟，头孢匹罗的检出限为20μg/kg，定量限为40μg/kg。采用基质匹配法对以上7种头孢菌素奶粉添加样品进行定量，在添加浓度水平为20μg/kg～200μg/kg范围内，头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢洛宁的回收率为62%～90%，RSD为3%～11%。在添加浓度水平40μg/kg～200μg/kg范围内，头孢喹肟，头孢匹罗的回收率为67%～85%，RSD为5%～10%。该方法准确度和精密度性能良好，适用于奶粉中上述7种头孢菌素的多残留检测。

关键词：奶粉 头孢氨苄 头孢匹林 头孢唑啉 残留

头孢菌素是由冠头孢菌培养液中分离出的头孢菌素C，经半合成制得的一类β-内酰胺类抗生素。该类抗生素的抗菌作用机制为其可抑制细菌细胞壁黏肽合成酶，影响细菌细胞壁黏肽合成，使细菌细胞壁缺损，水分由外环境不断进入高渗的菌体内，导致菌体在无细胞壁约束的情况下不断膨胀裂解死亡[1]。头孢菌素抗生素品种繁多且不断更新，典型的有头孢氨苄、头孢匹林、 头孢唑啉、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢匹罗、头孢洛宁、头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮等。

头孢菌素抗生素目前主要用于治疗革兰氏菌如葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌、大肠杆菌、嗜血杆菌、沙门氏菌等引起的各种感染[2]。在畜牧业中常用来控制奶牛乳房炎[3～5]，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道等感染。在防止动物疾病的过程中，由于人为使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，易造成头孢菌素抗生素在动物产品中的残留，然后通过食物链的传递富集，给人类健康带来严重危害，主要体现在对人体肾脏和肝脏功能的损害[6]，产生过敏反应可致皮疹、荨麻疹、哮喘、药热、血清病样反应、血管神经性水肿、过敏性休克等，导致胃肠道反应和胃肠道菌群失调，细菌耐药性等[7]。为此，欧盟、中国、美国、日本等国家已对动物源食品中头孢菌素抗生素残留量做出了最大残留限量值的规定，牛奶中的限量要求一般为0.01～0.1mg/kg之间，最严格的头孢洛宁为0.01mg/kg。

目前，头孢菌素残留的常规检测方法有微生物法、荧光法、液相色谱-紫外法、液相色谱-质谱法等，多为单项检测或少数几种头孢菌素的多残留检测。本文针对头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢匹罗、头孢洛宁7种头孢菌素类抗生素建立了一种专属性强、灵敏度高和分析时间短的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，以保障对动物源性食品中该类药物残留的确证检测。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

Waters Xevo TQD；分析天平（感量0.00001g）；天平（感量0.01g）；高速冷冻离心机；涡旋混合器；水平振荡器；固相萃取装置；Waters HLB固相萃取柱（500mg/6mL）；氮吹仪；滤膜（0.22μm）。

1.2 试剂和标准品

乙腈、甲醇、正己烷均为HPLC级； 磷酸氢二钾、氢氧化钾、氯化钠均为分析纯；头孢喹肟、头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢噻呋、头孢匹罗，纯度均>98%。

0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（PH=8.5）：称取8.7g磷酸氢二钾，超纯水溶解，稀释至1000mL，调PH至8.5±0.1。

标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量的头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢喹胿、头孢匹罗、头孢洛宁，用乙腈-水溶液溶解稀释，分别配制成1000mg/L的标准储备液，-10℃下保存，有效期为1年。

混合标准工作液（5mg/L）：分别准确吸取适量的标准储备液，用乙腈-水溶液配置成5mg/L的标准工作液，4℃下保存，有效期为1周。

1.3.样品的提取与净化

1.3.1提取

称取0.5g奶粉试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加入4.0mL水，使奶粉充分溶解，加入25mL乙腈+水（15+2），用均质器均质1min，于10℃、9500r/min条件下离心10min，取出上清液。

1.3.2净化

准确移取20.0mL提取液至离心管中，加入10mL乙腈饱和正己烷振荡1min，静置，弃掉正己烷，于40℃条件下氮吹至近干。用10mL磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，涡旋混匀，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，然后以1mL/min的流速上样HLB柱。先用2mL磷酸盐缓冲溶液淋洗2次，再用1mL纯水淋洗，弃去全部流出液。用3mL乙腈洗脱，收集洗脱液于15mL玻璃试管中，于40℃条件下氮吹近干，用纯水定容至2mL，混匀后，过0.22μm滤膜，供超高效液相色谱串联质谱仪定。

1.3.3 测定

液相色谱条件：色谱柱：Waters AQ BEH C181.7μm，2.1mmx100mm；流动相：A：0.1%乙酸水溶液 B：乙腈；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；进样量：5μL。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子扫描；多反应选择离子检（MRM）；毛细管电压为3kV；雾化气温度500℃；去溶剂气流速800L/hr。

2. 结果与讨论

2.1.提取和净化过程对回收率的影响

奶粉中含有脂肪、蛋白质、乳糖、无机离子等成分，理想的提取和净化过程不仅可以有效去除干扰物质，得到可靠的定性结果，同时又不会对目标分析物造成过多的损失，得到准确的定量结果。本试验分别考察了乙腈+水（15+2）提取过程，乙腈饱和正己烷去脂过程和HLB-SPE固相萃取净化过程对奶粉中7种头孢分析物回收率结果的影响，见表2.1。

结果发现：乙腈饱和正己烷净化过程和HLB-SPE固相萃取净化过程对奶粉中7种头孢类分析物的回收率均达85%以上，仅乙腈+水（15+2）提取过程对头孢氨苄的提取效果较差，回收率不足60%，说明该试剂对头孢氨苄的提取效率较低。因此，需要对头孢氨苄的提取试剂进行优化。

2.2.浓缩方式的选择

有机试剂提取后需要对20mL样品提取液进行浓缩至近干。为了提高浓缩效率，同时降低浓缩过程对7种头孢分析物的影响，本试验分别考察了旋蒸，氮吹，旋蒸后氮吹3种方式的浓缩效果，见表2.2。

结果发现，40℃条件进行旋蒸浓缩，头孢氨苄损失明显，回收率不足30%，头孢洛宁的回收率也不足80%；40℃条件下进行氮吹浓缩，7种头孢菌类分析物的回收率在70%～110之间；40℃条件下先旋蒸，再氮吹至近干，7种头孢类分析物的回收率在80%～100%之间。因此，综合考虑工作效率和回收率结果，本实验选择40℃条件下氮吹至近干的浓缩方式。

2.3.方法验证参数

2.3.1 线性

用奶粉空白基质溶液分别配制浓度水平为2，5，10，20，50，100μg/L的头孢菌素标准工作校正曲线，验证该方法的线性范围。如表2.3所示，在2～100μg/L浓度范围内7个头孢菌素基质匹配校正曲线的相关系数R2均大于0.99。

2.3.2 灵敏度

按1.3节方法处理奶粉样品，以S/N≥3确定检出限（LOD），以S/N≥10确定定量限（LOQ）。如表2.3所示，头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢洛宁在奶粉中的检出限（LOD）为10μg/kg，定量限（LOQ）为20μg/kg，头孢喹肟、头孢匹罗在奶粉中的检出限（LOD）为20μg/kg，定量限（LOQ）为40μg/kg。

2.3.3 回收率和精密度

用奶粉空白样品分别制备浓度水平为20μg/kg，40μg/kg，80μg/kg，200μg/kg的添加样品，每个水平制备3个平行样品，用基质匹配校正曲线计算添加目标物的回收率和相对标准偏差。如表2.3所示，在20～200μg/kg浓度范围内，头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、头孢洛宁的回收率为62%～90%，RSD为3%～11%，在该浓度范围内可以准确定量。在40～200μg/kg浓度范围内，头孢喹肟，头孢匹罗的回收率为67%～85%，RSD为5%～10%。

3. 结论

本文建立了HLB固相萃取净化-超高效液相色谱串联质谱检测奶粉中头孢氨苄、头孢匹林、头孢唑啉、头孢噻呋、 头孢喹肟、头孢匹罗、头孢洛宁7种头孢菌素残留量的方法。本方法准确度和精密度良好，适用于奶粉中上述7种头孢菌素残留量的检测。

参考文献

[1] 刘世良.抗菌药物作用机制的研究[J].中外医疗，2012（4）；35.

[2] 中国兽药典委员会.中国兽药典[M].北京：化学工业出版，2005.

[3] Bryan MA，HeuerC，Emslie FR.New Zeal Vet J，2011.59（4）：166.

[4] Shephard RWBurmanS，Marcun P.Aust Vet J，2004，82（10）：624.

[5] McDougall S.New Zeal Vet J，2010，58（1） ： 45.

[6] 白国涛，储晓刚，潘国卿等.色谱.2009，27（4）：417.

[7] 陈号，彭开松，朱良强等.动物源食品中内酰胺类药物残留分析方法的研究进展[J].中国兽药杂志，2008，42（5）：42-45.