健脾养正消癥汤干预己糖激酶2介导的糖代谢调控胃癌细胞增殖和凋亡

商佳荣，郑侠，钱军

南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210004

胃癌是常见消化道恶性肿瘤，根据世界卫生组织数据显示，2020年我国因胃癌死亡人数为37.4万，居我国癌症死亡原因第3位[1]。由于胃癌早期症状不明显，确诊时多为晚期甚至发生转移，五年生存率约35.1%[2]。近年来，内镜检查、手术、放化疗、免疫和靶向治疗在胃癌中取得了突破，然而依然存在复发转移率高、药物耐受性等难题，严重影响患者的生存和生活质量。因此，探索高效低毒的药物和精准靶点，提高胃癌治疗的疗效和安全性具有重要意义。

胃癌的发展与细胞能量代谢关系密切，胃癌细胞通过调节葡萄糖摄取、乳酸生成等代谢途径，为其增殖、侵袭、转移及逃逸等创造有利条件，有助于其在肿瘤进展期间无限增殖和存活。胃癌细胞在恶性转化的过程中，细胞的代谢模式从氧化磷酸化转化为糖酵解以满足更多的能量需求[3]。己糖激酶是糖酵解过程的第一个限速酶，可磷酸化己糖变为己糖-6-磷酸。已知的己糖激酶有4种（HK1～HK4），其中己糖激酶2（HK2）在很多和有氧糖酵解增强有关的肿瘤中表达上调[4]。HK2可加速胃癌细胞对葡萄糖的摄取，促进糖代谢，进而促进癌细胞的增殖和肿瘤进展[5]。因此，抑制胃癌糖代谢途径相关基因、蛋白表达及通路激活，可能是抑制胃癌肿瘤细胞进展的关键。

中医药治疗胃癌等恶性肿瘤不仅能显著改善临床症状，直接发挥抗癌作用，还能联合手术、放化疗、靶向及免疫治疗等发挥增效减毒作用。首届全国名中医刘沈林教授针对胃癌治疗，在汲取前人经验基础上，通过长期临床实践总结，提出“脾虚正衰是病机关键，癌毒是重要病理因素”，并由《何氏虚劳心传》健脾资生丸及《沈氏尊生书》血癥丸化裁而成健脾养正消癥汤[6]。临床试验显示，健脾养正消癥汤可显著延长胃癌晚期患者生存期，提高其生活质量[7]。然而，对于健脾养正消癥汤治疗胃癌的具体分子生物学机制尚未完全阐明。本研究通过网络药理学方法及实验验证，探索健脾养正消癥汤通过影响糖代谢途径治疗胃癌的分子生物学作用机制，为健脾养正消癥汤的开发和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 健脾养正消癥汤有效成分及靶点获取

通过TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索健脾养正消癥汤11味组方药物“黄芪”“党参”“白术”“当归”“白芍”“陈皮”“三棱”“莪术”“石见穿”“白花蛇舌草”“甘草”的活性成分，以类药性（DL）≥0.18且口服生物利用度（OB）≥30%的化合物作为健脾养正消癥汤有效活性成分，同时收集和整理活性成分对应的靶点。将所得活性成分输入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载化学成分标准化格式的SMILES号，并将其输入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平台进行靶点预测。根据UniProt（https://www.uniprot.org）数据库对靶点信息进行比对、校正，将SwissTargetPrediction和TCMSP靶点合并、去重，获得活性成分靶点，构建健脾养正消癥汤活性成分靶点数据库。

1.1.2 胃癌糖代谢相关靶点检索

以检索表达式“glycometabolism” AND“gastric cancer”，在GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库检索相关疾病靶点，以Relevance score＞1为标准选取疾病靶点，比对UniProt数据库，构建疾病相关靶点数据库。利用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）映射疾病靶点与健脾养正消癥汤活性成分靶点的交集。

1.1.3 中药-活性成分-靶点网络构建

将交集靶点数据导入Cytoscape3.9.1软件（https://cytoscape.org/），构建中药-活性成分-靶点网络，以直观展现药物活性成分与疾病间相互关系。利用CytoNCA插件对该网络进行拓扑分析，计算节点的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC）。网络中节点的值越大，相互作用关系就越多，越可能为该网络的关键节点。

1.1.4 蛋白相互作用网络构建

基于STRING（https://string-db.org/）数据库获取潜在靶点蛋白相互作用（PPI）关系，设定物种为“Homo Sapiens”（人类），筛选并构建PPI网络。借助Cytoscape对PPI网络进行挖掘分析，基于CytoNCA插件计算PPI网络中各节点的DC、BC、CC进行拓扑分析，选取DC、BC、CC值均高于中位数的靶点作为核心靶点。

1.1.5 GO、KEGG及DO富集分析

运用RStudio软件包ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db、ggnewscale、pathview对健脾养正消癥汤干预胃癌糖代谢的潜在靶点进行GO、KEGG和DO富集分析。以P＜0.05为条件进行筛选，得到健脾养正消癥汤干预胃癌糖代谢的主要功能、通路及相关疾病，并对结果进行可视化处理。

1.1.6 分子对接

借助PubChem数据库，查找健脾养正消癥汤主要活性成分的3D结构，输入OpenBabel3.1.1（http://openbabel.org/），保存为mol2格式。依据RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）数据库，查找核心靶点的蛋白晶体结构，利用PyMOL（https://pymol.org/）软件对其进行去水、加氢，并输出为pdb格式。最后使用Autodock Tools（https://autodock.scripps.edu/）软件进行分子对接分析。

1.2 细胞实验验证

1.2.1 动物、试药与仪器

SPF级SD雄性大鼠16只，8～10周龄，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。于温度（20±2）℃、湿度50%±10%、12 h/12 h光暗循环条件下，适应性饲养7 d后开始实验。人胃癌细胞HGC-27、AGS，购于中国科学院上海细胞库，南京中医药大学附属医院中心实验室常规培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素溶液的RPMI-1640完全培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，取对数期细胞进行实验。动物实验经南京中医药大学附属医院伦理委员会审批（2020NL-107-1）。

健脾养正消癥汤（党参30 g，黄芪60 g，麸炒白术10 g，炒白芍10 g，当归10 g，石见穿15 g，三棱30 g，莪术30 g，白花蛇舌草15 g，陈皮6 g，甘草5 g）饮片购于南京中医药大学附属医院，加10倍量水常规煎煮，重复煎煮2次，所得药液混合、过滤、灭菌、蒸发、浓缩，使其终浓度为1 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存备用。

10%胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司，批号20010401；1%青-链霉素溶液的RPMI-1640培养基，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号分别为2085154、2240832。葡萄糖测定试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司，批号20181209290；乳酸测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20190603；HK2抗体，美国Proteintech公司，批号66287-1-lg；二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号134293。

1300A2型生物安全柜（美国Thermo公司），IX51型倒置显微镜（日本Olympus公司），ELx800型全自动酶标仪（美国BioTek公司），C6流式细胞仪（美国BD公司），PowerPacTMBasic型电泳仪及转膜仪（美国Bio-Rad公司），Tanon-5500型化学发光凝胶成像仪（中国天能科技有限公司），HERAcell 1501型CO2培养箱（美国Thermo公司）。

1.2.2 含药血清制备

将16只大鼠随机分为含药血清组和对照血清组。依据预实验结果，根据体表面积计算给药剂量，含药血清组予23.02 g/kg健脾养正消癥汤灌胃，对照血清组予0.9%氯化钠注射液4 mL灌胃，每日2次，连续3 d。第4日禁食不禁水12 h，一次性灌胃全天剂量后1 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主动脉取血，37 ℃静置4 h，2 000 r/min离心15 min，分离血清，混合同组血清后，0.22 μm醋酸纤维素膜过滤2次，56 ℃水浴30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 细胞分组

将HGC-27、AGS细胞分别分为含药血清组（79%RPMI-1640培养基+20%大鼠含药血清+1%青-链霉素）和对照血清组（79%RPMI-1640培养基+20%大鼠对照血清+1%青-链霉素）。每组设置3个重复，将细胞置于无血清培养基中培养2 h后再进行后续处理。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期HGC-27、AGS细胞接种至6孔板，根据不同分组采用相应培养基作用48 h，收集HGC-27、AGS细胞，加70%乙醇4 ℃固定过夜；PBS冲洗2次，加入RNase，37 ℃水浴30 min；PBS再次洗涤2次后，加入碘化丙啶（PI），4 ℃避光染色30 min，400目滤网过滤1次，1 000 r/min离心5 min，弃去PBS，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 糖酵解水平检测

HGC-27、AGS细胞根据不同分组采用相应培养基作用48 h，收集HGC-27、AGS细胞，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液-20 ℃冰箱保存备用。按葡萄糖检测试剂盒（葡萄糖氧化酶法）、乳酸检测试剂盒说明书检测细胞葡萄糖摄取量、乳酸生成量。

1.2.6 Western blot检测己糖激酶2蛋白表达水平

HGC-27、AGS细胞根据不同分组采用相应培养基作用48 h，加RIPA，于冰上裂解20 min，13 000 r/min离心5 min，吸取上清液，采用蛋白质定量试剂盒（BCA法）测定蛋白浓度。取适量蛋白制胶上样，凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭。2 h后用PBS清洗3次，加入稀释后的一抗（1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜。弃一抗液，PBS清洗膜后，加入二抗（1∶6 000），室温下振荡孵育1 h。清洗膜后，加入ECL液显影，使用凝胶成像系统显影拍照。以Actin为参照，采用Image J软件分析灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以表示，满足正态分布时，2组间比较采用t检验或非参数检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析结果

2.1.1 健脾养正消癥汤活性成分及靶点

共收集健脾养正消癥汤的活性成分181种，其中黄芪20种、党参24种、白术7种、当归2种、白芍13种、陈皮5种、三棱5种、莪术3种、石见穿3种、白花蛇舌草7种、甘草92种。共得到药物活性成分靶点4 094个，其中黄芪615个、党参511个、白术249个、当归96个、白芍316个、陈皮223个、三棱181个、莪术157个、石见穿290个、白花蛇舌草444个、甘草1 012个，剔除重复后获得1 179个靶点。

2.1.2 胃癌糖代谢相关靶点

通过GenCards数据库检索与筛选，共获得176个疾病相关靶点，对疾病与药物靶点映射后，选取潜在作用靶点37个。经靶点比对，获得124个活性成分，建立中药成分与靶点关系。

2.1.3 中药-活性成分-靶点网络

借助Cytoscape3.9.1构建中药-活性成分-靶点网络，并应用CytoNCA插件对该网络进行拓扑分析，得到DC中位数为3，BC中位数为44.577 09，CC中位数为0.407 714，三者均大于中位数的节点被认为是该网络的关键节点，前20个节点见表1。健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径主要活性成分见表2。对关键节点中的活性成分构建中药-活性成分-靶点网络，该网络由149个节点和402条边组成，见图1。

图1 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径中药-活性成分-靶点网络

表2 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径活性成分

2.1.4 核心基因互作网络

通过STRING对37个潜在基因构建PPI关系，经Cytoscape3.9.1处理，结果见图2。利用Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析，其中BC、CC、DC均大于其中位数的基因共14个，见表3。其中GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2等具有较多的互作关系，选取为核心基因进一步研究靶点的功能。

图2 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径靶点PPI网络

表3 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径核心靶点

2.1.5 富集分析结果

通过R语言对健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径的37个潜在靶点进行GO、KEGG和DO富集分析。GO富集分析得到1 016条结果，其中生物过程（BP）900条、细胞组成（CC）63条、分子功能（MF）113条，主要包括前体代谢物和能量的产生、对营养水平的反应、对细胞外刺激的反应、NADP代谢过程等生物过程，囊泡腔、内质网腔、黑色素体、内质网伴侣复合体等细胞组成，NADP结合、泛素蛋白连接酶结合、ATP水解活性等分子功能。见图3。KEGG通路富集分析得到46条通路，前20条通路见图4，其中碳代谢、HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的中心碳代谢等通路与健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径密切相关。DO富集分析得到200个条目，包括胃癌在内的多种癌症，前20个条目见图5。

图3 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径靶点GO富集分析

图4 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径靶点KEGG通路富集分析

图5 健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径靶点DO富集分析

2.1.6 分子对接

选取3个主要活性成分槲皮素（MOL000098）、柚皮素（MOL004328）、光甘草定（MOL004908）与10个显著表达的基因GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1进行分子对接模拟，结果见图6。通常认为，结合能＜0 kcal/mol则小分子配体和受体蛋白能够自发结合，结合能＜-5.0 kcal/mol表明结合活性良好[8]。对接结果显示，健脾养正消癥汤主要活性成分与靶点均可以自发结合，平均最低结合能为-7.36 kcal/mol。其中HK2、EGFR与活性成分结合能最低，其对接模式见图7。

图6 健脾养正消癥汤主要活性成分与核心靶点对接结合能热图

图7 健脾养正消癥方主要活性成分与靶点分子对接模式

2.2 细胞实验结果

2.2.1 健脾养正消癥汤对HGC-27、AGS细胞凋亡的影响

与对照血清组比较，含药血清组细胞凋亡率均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图8。

图8 2组HGC-27、AGS细胞凋亡率比较（）

2.2.2 健脾养正消癥汤对HGC-27、AGS细胞己糖激酶2蛋白表达的影响

与对照血清组比较，含药血清组HGC-27、AGS细胞HK2蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图9。

图9 2组HGC-27、AGS细胞HK2蛋白表达比较（）

2.2.3 健脾养正消癥汤对HGC-27、AGS细胞有氧糖酵解水平的影响

与对照血清组比较，含药血清组HGC-27、AGS细胞葡萄糖摄取量明显减少（P＜0.05），乳酸生成量明显减少（P＜0.01）。见图10。

图10 2组HGC-27、AGS细胞有氧糖酵解水平比较（）

3 讨论

胃癌以本虚标实、虚实夹杂为主要病机，“本虚”以脾胃虚弱，“标实”以水湿、痰浊、瘀血与癌毒邪气搏结而积聚成块[9]。胃癌细胞的能量代谢与其生长、增殖、侵袭、上皮-间质转化等恶性生物学过程密切相关，肿瘤细胞在快速生长过程中过度消耗机体内能量，加重机体气血缺乏、正气不足的病理状态。机体局部气血阻滞，血脉不畅，氧气和营养物质匮乏，促进肿瘤细胞糖酵解的产生。健脾养正消癥汤正是依据脾气虚损之“本虚”和癥瘕积聚之“标实”病机立方，由黄芪、党参、麸炒白术、莪术、三棱、石见穿等11味中药组成，诸药并用，可扶正健脾益气以补中气、养营血，兼顾行气滞、利湿浊、消癥结、解癌毒功效。

网络药理学结果显示，槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚等为健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径发挥作用的有效成分。槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚均为具有活性的黄酮类化合物，对肿瘤细胞能量代谢有一定调控作用。槲皮素可通过靶向葡萄糖代谢所需关键酶来减少糖酵解[10]，如槲皮素通过抑制己糖激酶表达，促使肿瘤细胞的糖酵解程序陷入紊乱，诱发凋亡信号通路，促进肿瘤凋亡[11]。光甘草定作为黄酮类化合物，也可以减少葡萄糖摄取、抑制糖酵解、下调HK2和乳酸脱氢酶A表达[12]。有研究发现，光甘草定能够抑制糖酵解途径而调控肿瘤细胞的能量代谢，通过抑制葡萄糖转运子1蛋白表达减少MDA-MB-231细胞对葡萄糖的摄入，降低细胞内ATP水平、乳酸脱氢酶活性、乳酸浓度[13]。山柰酚抑制HK2和电压依赖性阴离子通道蛋白1的线粒体结合而削弱有氧糖酵解，对抗肿瘤细胞转移[14]，同时靶向相关基因和通路干预肿瘤细胞的糖酵解[15-16]，从而起到抗肿瘤作用。

KEGG富集分析所涉及的通路有碳代谢、HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的中心碳代谢通路。碳细胞在恶性转化过程中需要特异性的新陈代谢途径来维持成长和生存，包括糖酵解、失调的三羧酸循环和戊糖磷酸途径等[17]。碳代谢信号通路和癌症中的中心碳代谢通路可以影响肿瘤至关重要的代谢网络，在肿瘤发生、转移和对治疗的抗性中起着关键作用[18]。糖酵解/糖原异生是肿瘤细胞能量代谢的主要途径，肿瘤细胞优先利用糖酵解产生能量，通过影响糖酵解途径可以抑制肿瘤细胞的生长[19]。HIF-1信号通路在控制肿瘤对缺氧的反应中起着重要作用，通过HIF-1转录因子实现葡萄糖代谢的重新编程。可见健脾养正消癥汤可通过干预肿瘤代谢途径起到治疗胃癌的作用。

本研究得到健脾养正消癥汤作用于胃癌糖代谢途径关键靶点有GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1。分子对接结果显示，健脾养正消癥汤有效活性成分和靶点蛋白的结合性能良好，其中HK2与活性成分具有较强的结合活性。己糖激酶在糖酵解中起到至关重要的作用，其中同工酶HK2与肿瘤细胞的能量代谢紧密相关，对糖酵解过程起到调控作用，在多种癌细胞中呈现过表达，参与了肿瘤发生发展甚至转移过程[20-22]。HK2作为糖酵解中的限速酶，其表达量及活性增加为肿瘤组织的生物学过程提供了足够的能源[23-24]。胃癌肿瘤细胞中具有异常活跃的能量代谢，通过异常的糖代谢过程来逃避正常的细胞凋亡程序，增强癌细胞增殖和迁移能力，其反应过程受到HK2的影响。已有实验表明，多种中药成分可通过降低胃癌细胞HK2表达，减少细胞葡萄糖消耗和乳酸产生，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[25]。本研究细胞实验发现，健脾养正消癥汤干预胃癌细胞后，胃癌细胞凋亡率明显升高，胃癌细胞葡萄糖消耗率及乳酸产量均明显降低，同时，Western blot结果显示，HK2蛋白表达受到抑制。因此，证明健脾养正消癥方能够在体外抑制胃癌细胞的有氧糖酵解水平，促进胃癌细胞凋亡。

综上所述，通过网络药理分析发现健脾养正消癥汤有效活性成分可作用于HK2靶点蛋白，干预胃癌细胞糖代谢过程，并通过细胞实验进行验证。本研究中健脾养正消癥汤展现对胃癌细胞增殖的抑制效果，表明胃癌患者联用中药干预有助于减缓肿瘤的增长速率，从而使其临床进一步获益。本实验仅针对HK2靶点蛋白表达进行了验证，没有进一步研究健脾养正消癥汤干预HK2的具体通路及其他相关蛋白表达情况，存在一定局限性。通过网络药理学分析得到健脾养正消癥汤干预胃癌糖代谢途径的多个靶点及通路，后续将在本研究基础上进一步拓展健脾养正消癥汤干预肿瘤糖代谢治疗胃癌的机制研究。