基于IL-1β探讨矢志方对高尿酸血症小鼠肾组织OAT1/3表达的影响

王传旭，周嘉宝，吴志远，吴燕升，郭亚芳，高建东

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学中医肾病研究所，上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；3.复旦大学附属浦东医院，上海 201399

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是由于嘌呤代谢紊乱，尿酸生成过多或排泄减少，导致血清尿酸水平升高超过其临界值的一种代谢性疾病[1]。尿酸被认为是慢性肾脏病肾损伤的独立危险因素，高水平尿酸诱导的炎症反应是肾小管损伤的中心机制[2-3]。目前临床常用降尿酸药物黄嘌呤氧化酶抑制剂如非布司他、别嘌醇，促尿酸排泄药物如苯溴马隆，长期服用存在一定不良反应[4-6]。

尿酸在多种信号通路中发挥促炎作用，可溶性尿酸和尿酸结晶均可激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体，通过白细胞介素（IL）-1β等细胞因子触发免疫反应[7]。尿酸主要通过肾脏排泄，其在肾小管的重吸收和分泌是由不同转运蛋白完成，其中有机阴离子转运蛋白（OAT）1和OAT3是表达于肾小管的功能蛋白，在肾小管尿酸分泌中起关键作用[8]。肝细胞核因子（HNFs）首先被鉴定为肝脏所富含的转录因子，之后发现其在其他多个组织和器官中表达，发挥调节发育和器官功能作用[9]。研究表明，HNF1α、HNF4α参与OAT1和OAT3的调控[10-11]，IL-1β又可抑制HNF1α/HNF4α及其下游靶基因表达[12-13]。抑制IL-1β信号通路可减轻炎症，还可促进OAT1、OAT3表达，减轻肾损伤，发挥保护肾脏作用[14-15]。

矢志方是上海中医药大学附属曙光医院肾内科临床经验方，具有化痰祛湿、活血化瘀功效。研究表明，矢志方治疗痰浊瘀阻型尿酸性肾病具有较好临床疗效，并可通过清除或抑制氧自由基改善尿酸性肾病氧化应激状态，保护肾功能[16-17]。此外，矢志方通过抑制活性氧及下游NLRP3-ASC-Caspase-1通路激活，减少IL-1β、IL-18活化和释放，减轻HUA肾小管炎症损伤[18]，降低血尿酸水平[19]。因此，本实验通过氧嗪酸钾灌胃建立HUA小鼠模型，基于炎症因子IL-1β观察矢志方对HUA小鼠肾组织OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表达的影响，为明确矢志方治疗HUA的作用机制提供更多依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性BALB/c小鼠32只，8周龄，体质量12～22 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于上海中医药大学实验动物中心，温度25℃，相对湿度45%，12 h光照，自由摄食饮水。本实验经上海中医药大学伦理委员会批准（PZSHUTCM211227011）。

1.2 药物

矢志方（车前子30 g，芥子15 g，王不留行15 g，冬葵子15 g），饮片购自上海中医药大学附属曙光医院，并委托国家中药制药工程技术研究中心制备成中药复方颗粒剂（1 g颗粒相当于原方20 g），使用时用蒸馏水配制成70 mg/mL药液。非布司他片，40 mg/片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20130081，将药片粉碎，以蒸馏水溶解，配制成0.75 mg/mL药液。

1.3 主要试剂与仪器

氧嗪酸钾、羧甲基纤维素钠（CMCC-Na），上海麦克林生化科技有限公司，货号分别为P831461、C10097951；IL-1β，武汉ABclonal有限公司，货号A16288；HNF1α抗体，英国Abcam公司，货号分别为ab272693（Western blot）、ab268116（免疫荧光）；HNF4α抗体，英国Abcam公司，货号分别为ab201460（Western blot）、ab41898（免疫荧光）；OAT1抗体，英国Biorbyt公司、美国Immunoway公司，货号分别为orb11177（免疫荧光）、YT3220（Western blot）；OAT3抗体，英国Biorbyt公司、北京博奥森，货号分别为orb136646（免疫荧光）、bs-0609R（Western blot）；β-actin，美国Proteintech公司，货号66009-1；HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG，上海碧云天，货号分别为A0216、A0208、A0423、A0473；PVDF膜，美国Millipore公司，货号IPVH00005。离心机，美国Beckman公司，型号Avanti J-E；凝胶成像系统，上海天能，型号Tanon-5200；生物组织冷冻包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-BM；烘片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，型号KD-H；酶标仪，美国BioTek公司，型号Synergy 2；组织匀浆器，上海净信科技有限公司，型号JY-24；显微镜，日本奥林巴斯，型号CX33。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药

32只小鼠适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、非布司他组和矢志方组，每组8只。正常组予生理盐水灌胃，其余各组予250 mg/kg氧嗪酸钾溶液灌胃制备HUA小鼠模型。4 h后非布司他组灌胃非布司他药液6 mg/kg，矢志方组灌胃矢志方药液562.5 mg/kg，给药剂量为成人剂量的9倍，灌胃体积0.2 mL，每日1次，正常组和模型组予等体积生理盐水灌胃，造模与给药同时进行，连续2周。

2.2 取材

第13日给药后小鼠禁食不禁水，第14日给药后，0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘取双侧肾脏，切去肾盂，剩余肾组织分别用于病理观察、Western blot和免疫荧光染色。

2.3 病理观察

小鼠肾组织经4%中性固定液固定24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度4μm），脱蜡后进行HE、Masson染色，中性树脂封片，光镜下观察小鼠肾组织病理形态。

2.4 Western blot检测

取20 mg小鼠肾组织，加入RIPA裂解液200μL，匀浆机65 Hz匀浆1 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，BCA法测定蛋白浓度，加入loading buffer和生理盐水配制成浓度为40μg/μL的等量蛋白样品。上样，120 V电泳1 h，300 mA、1 h转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入IL-1β一抗（1∶1 000）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶1 000）、OAT3一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶5 000），4℃孵育过夜；PBST洗膜3次，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）、山羊抗兔IgG（1∶1 000），室温孵育1 h；PBST洗膜3次，ECL化学发光法显影，凝胶成像系统拍摄。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.5 免疫荧光染色

肾组织石蜡切片经脱蜡、脱水，微波炉抗原修复后，1%BSA室温封闭1 h，加入1%BSA稀释的IL-1β一抗（1∶200）、HNF1α一抗（1∶1 000）、HNF4α一抗（1∶1 000）、OAT1一抗（1∶400）、OAT3一抗（1∶400），4℃孵育过夜；加入荧光二抗（1∶500），避光孵育1 h，加入DAPI染细胞核5 min，甘油封片，荧光显微镜下观察，计算阳性表达的面积比。

3 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件和Image J 1.8软件进行分析。实验数据以±s表示，多重比较采用方差分析和LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 矢志方对模型小鼠肾组织病理形态的影响

HE、Masson染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾小管管壁变薄，管腔扩张，间质炎性细胞浸润，纤维组织增生；与模型组比较，矢志方组和非布司他组小鼠肾小管管壁变薄、管腔扩张、炎性细胞浸润、纤维组织增生的病理变化减轻。见图1、图2。

图1 各组小鼠肾组织形态（HE染色，×200）

图2 各组小鼠肾组织形态（Masson染色，×200）

4.2 矢志方对模型小鼠肾组织白细胞介素-1β、有机阴离子转运蛋白1/3、肝细胞核因子1α/4α蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组小鼠肾组织IL-1β蛋白表达显 著 升 高（P＜0.001），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表达显著降低（P＜0.01，P＜0.001）；与模型组比较，非布司他组和矢志方组小鼠肾组织IL-1β蛋白表达显著降低（P＜0.05），OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1、图3。

图3 各组小鼠肾组织IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白免疫印迹

表1 各组小鼠肾组织IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表达比较（±s）

表1 各组小鼠肾组织IL-1β、OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组模型组非布司他组矢志方组只数4 4 4 4 IL-1β 0.51±0.10 1.20±0.20***0.85±0.11#0.77±0.18#OAT1 1.90±0.13 0.29±0.17***0.72±0.18#0.92±0.25##OAT3 1.21±0.28 0.36±0.08**0.95±0.10#0.94±0.25#HNF1α 0.98±0.02 0.06±0.02**0.75±0.25#0.36±0.19#HNF4α 0.99±0.05 0.12±0.01***0.74±0.10##0.51±0.10#

4.3 矢志方对模型小鼠肾组织炎症因子白细胞介素-1β表达的影响

免疫荧光染色显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织IL-1β表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；与模型组比较，矢志方组和非布司他组小鼠肾组织IL-1β表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图4、表2。

表2 各组小鼠肾组织IL-1β阳性表达比较（±s，%）

表2 各组小鼠肾组织IL-1β阳性表达比较（±s，%）

注：与正常组比较，***P＜0.001；与模型组比较，###P＜0.001

组别正常组模型组非布司他组矢志方组只数4 4 4 4 IL-1β 0.05±0.02 0.92±0.20***0.28±0.09###0.21±0.02###

图4 各组小鼠肾组织IL-1β阳性表达（免疫荧光染色，×200）

4.4 矢志方对模型小鼠肾组织有机阴离子转运蛋白1/3、肝细胞核因子1α/4α表达的影响

免疫荧光染色结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001）；与模型组比较，矢志方组和非布司他组小鼠肾组织HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。见图5、图6、表3。

表3 各组小鼠肾组织HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3阳性表达比较（±s，%）

表3 各组小鼠肾组织HNF1α、HNF4α、OAT1、OAT3阳性表达比较（±s，%）

注：与正常组比较，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

组别正常组模型组非布司他组矢志方组只数4 4 4 4 HNF1α 2.85±0.75 0.24±0.05***1.44±0.21##1.40±0.14##HNF4α 3.77±0.46 0.93±0.14***1.96±0.22##2.09±0.23###OAT1 12.63±1.16 2.17±0.64***4.42±1.05#8.49±0.92###OAT3 13.12±1.16 1.70±0.70***4.93±0.83###8.63±0.64###

图5 各组小鼠肾组织HNF1α、OAT1阳性表达（免疫荧光染色，×200）

图6 各组小鼠肾组织HNF4α、OAT3阳性表达（免疫荧光染色，×200）

5 讨论

HUA血尿酸水平升高与肾小管损伤相关，当血尿酸水平超过正常范围，可引起肾小管多种病理变化，如炎症、凋亡和纤维化等[20-22]，进一步促进慢性肾脏病肾损伤的发展。体外实验显示，尿酸可诱导肾小管上皮细胞NLRP3、IL-1β及肿瘤坏死因子-1α水平升高[23]。动物实验也显示，尿酸诱导大鼠肾脏巨噬细胞浸润，IL-1β表达增加，最终导致肾小管结构和功能损伤[24-25]。OAT1与OAT3通过有机阴离子与二羧酸的交换发挥排泄尿酸作用[26]。在敲除OAT1的小鼠中，肾小管分泌尿酸盐功能减弱[27]；在单侧输尿管梗阻模型中也发现因肾小管炎症损伤导致的OAT1和OAT3表达下降，而多种中药及其提取物通过抑制炎症相关信号通路，促进转运蛋白表达减轻HUA肾损伤[7，14-15]。

本实验通过氧嗪酸钾灌胃建立HUA小鼠模型。2周后，肾小管出现管壁变薄、管腔扩张、肾组织纤维化等病理改变，炎症因子IL-1β表达升高，OAT1、OAT3及HNF1α、HNF4α表达降低，提示HUA小鼠肾组织出现炎症损伤，肾小管转运功能下降，并伴有纤维化改变。给予矢志方治疗后，HUA小鼠炎症反应、肾组织损伤减轻，肾小管转运功能改善，纤维化病理改变减轻。

中医学认为，湿浊痰瘀是HUA的基本病机，痰瘀互结可能与HUA导致肾小管炎症损伤、尿酸排泄障碍有关。据此创立化痰祛湿、活血化瘀中药复方矢志方。该方以车前子、芥子为君药，利湿化痰、祛痰散瘀；配伍王不留行为臣，逐瘀通络，使瘀血化、痰湿去；佐以冬葵子利水消导，使邪有去路，津行得通。诸药合用则水道通利、脉道得通、血行得畅，共奏化痰祛湿、活血化瘀功效。

综上所述，矢志方可减轻HUA小鼠肾脏损伤，其机制与抑制肾组织炎症因子IL-1β，促进OAT1、OAT3、HNF1α、HNF4α表达有关。此外，HNF1α、HNF4α在矢志方调控IL-1β-OAT1/3中的具体机制还需进一步探索。