丹参通络解毒汤联合内皮祖细胞对心肌缺血再灌注损伤大鼠PI3K/Akt信号通路的影响

李彩云，肖青，李鑫辉，陈聪，杜建芳，王静雯，陈欣

湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是威胁人类生命健康的主要疾病之一，早期恢复缺血心肌再灌注可显著提高患者存活率，但易引发心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI）[1-2]，因此研发MIRI的靶点药物对防治AMI具有重要意义。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）具有较强的促血管生成和修复血管内皮功能[3]。Morishita等[4]研究表明，循环EPCs具有分化为成熟内皮细胞的能力，在心肌缺血和血管损伤时，EPCs可诱导血管生成和促进血管修复。中药干预可调控EPCs归巢、增殖及分化，并可增强其保护心肌的作用[5]。Li等[6]研究表明，丹酚酸A能增加EPCs数量，提高EPCs迁移能力，促进缺血心肌组织血管新生。另有研究表明，PI3K/Akt信号通路参与了MIRI引起的炎症和凋亡[7]。前期临床研究显示，丹参通络解毒汤可治疗冠心病不稳定型心绞痛[8]，但有关丹参通络解毒汤保护心肌的作用机制尚未完全明了。本研究从PI3K/Akt信号通路观察丹参通络解毒汤联合EPCs对MIRI模型大鼠心肌损伤的影响，探讨其可能的作用机制，为研发MIRI的靶点药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物及制备

丹参通络解毒汤（丹参15 g，玄参15 g，当归10 g，栀子15 g，黄连6 g，黄芪30 g），饮片由湖南中医药大学第一附属医院提供，常规煎煮、浓缩至含原药材3.5 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 动物

清洁级SD雄性大鼠，3～4周龄20只，体质量90～110 g；10～12周龄60只，体质量180～220 g，湖南中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。常规饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级动物房，室温20～25 ℃，相对湿度50%～60%，明暗12 h循环，普通词料喂养，自由摄食饮水。

1.3 主要试剂与仪器

内皮细胞基础培养基（EBM-2，美国Lonza公司，货号CC3156），LY294002（美国Sigma公司，货号S1105），p-PI3K一抗（美国Sigma公司，货号SAB1300436），p-Akt一抗（美国CST公司，货号AB1019），FITC标记兔抗大鼠CD133（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号Abp52923），PE标记山羊抗大鼠血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2，美国Epitomics公司，货号2296-1）。RM-6280型生理信号采集系统（成都仪器厂），HZQ-QB型恒温振荡摇床（苏州威尔实验用品有限公司），GE-100型凝胶电泳仪（杭州大和热磁电子有限公司），IX71型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），DH-140型小动物呼吸机（上海奥尔特生物科技公司）。

1.4 内皮祖细胞分离、培养及鉴定

取3～4周龄SD大鼠，胫骨及股骨骨髓腔中采集细胞，密度梯度离心法及差数贴壁法分离EPCs，镜下观察细胞生长情况。免疫荧光染色鉴定EPCs，取培养第10～14日细胞，接种至24孔板，4%多聚甲醛固定爬片，加入FITC标记兔抗大鼠CD133和PE标记山羊抗大鼠VEGFR-2孵育过夜，滴加二抗孵育，DAPI染细胞核，倒置荧光显微镜下观察。

1.5 分组、造模及给药

将10～12周龄SD大鼠随机分为假手术组、模型组、EPCs组、丹参通络解毒汤组（中药组）、丹参通络解毒汤＋EPCs组（联合组）、丹参通络解毒汤＋EPCs＋PI3K阻断剂组（阻断剂组），每组10只。参考文献[9]方法，采用左冠状动脉前降支结扎法制备MIRI大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉并固定，气管切开处接小动物呼吸机，暴露胸腔，在左心耳根部1～2 mm处进针，结扎大鼠左冠状动脉前降支，心电图显示ST段弓背向上抬高，QRS波群改变，J点偏移超过0.1 mV，缺血区心肌颜色变白；结扎30 min后松开结扎线实现再灌注，ST段出现回落，可见梗死区心肌充血，表明再灌注成功，关闭胸腔。假手术组只穿线不结扎。EPCs组、联合组和阻断剂组大鼠术后尾静脉注射含1.0×106个EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen Vector的PBS 1 mL，其余各组大鼠尾静脉注射1 mL PBS；阻断剂组大鼠尾静脉注射LY294002稀释液（0.3 mg/kg）[10]，中药组、联合组和阻断剂组大鼠术后每日予丹参通络解毒汤药液灌胃，参照人与大鼠体表面积换算给药剂量，相当于原药材18.125 g/kg，给药体积10 mL/kg，其余各组予等体积生理盐水灌胃，连续14 d。

1.6 心功能检测

切开大鼠气管，接呼吸机辅助通气后，动脉夹阻断右颈总动脉血流，并在其上剪一“V”字切口，将其充满肝素水，一端连接RM-6280型生理信号采集系统PE-50导管，插管至左心室，监测左心室形成压（LVDP）、左心室收缩压（LVSP）、左心室射血分数（LVEF）。

1.7 病理观察

取大鼠心肌组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（4 μm），放入二甲苯中浸泡，行HE染色，封片，光学显微镜下观察心肌组织病理形态。

1.8 Western blot检测

取大鼠心肌组织，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，上样，SDS-PAGE后转膜至PVDF膜，加入稀释的p-PI3K、p-Akt一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶3 000），37 ℃孵育1 h，化学发光液显影，凝胶成像系统采集图像，Image Pro Plus 6.0软件分析，以GAPDH为内参，计算各条带灰度值。

1.9 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，符合正态分布及方差齐性用方差分析，两两比较用LSD法，方差不齐用Games-Howell检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮祖细胞鉴定

对分离培养的细胞进行鉴定，倒置荧光显微镜下观察VEGFR-2、CD133阳性表达，表明分离培养的细胞为EPCs。见图1。

图1 EPCs VEGFR-2和CD133阳性表达（免疫荧光染色，×100）

2.2 丹参通络解毒汤和内皮祖细胞对模型大鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，EPCs组、中药组、联合组及阻断剂组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与EPCs组比较，中药组、联合组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显升高（P＜0.05，P＜0.01），阻断剂组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显降低（P＜0.01）；与中药组比较，联合组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显升高（P＜0.01），阻断剂组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显降低（P＜0.01）；与联合组比较，阻断剂组大鼠LVDP、LVSP和LVEF明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠LVDP、LVSP和LVEF比较（±s）

表1 各组大鼠LVDP、LVSP和LVEF比较（±s）

注：1 mm Hg＝0.133 kPa；与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与EPCs组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药组比较，▲▲P＜0.01；与联合组比较，★★P＜0.01

组别 只数 LVDP/mm Hg LVSP/mm Hg LVEF/%假手术组 10 80.03±3.54 125.50±3.31 85.75±2.21模型组 10 50.50±3.57** 92.30±3.43** 41.49±3.47**EPCs组 10 62.61±3.59## 105.94±4.45## 65.86±2.97##中药组 10 65.90±2.96##△ 109.96±4.40##△ 68.75±2.49##△联合组 10 72.67±3.79##△△▲▲ 115.90±2.74##△△▲▲ 75.56±3.46##△△▲▲阻断剂组 10 53.68±3.53#△△▲▲★★ 96.03±2.78#△△▲▲★★ 44.58±2.44#△△▲▲★★

2.3 丹参通络解毒汤和内皮祖细胞对模型大鼠心肌组织形态的影响

假手术组大鼠心肌纤维排列较整齐，无明显炎性细胞浸润；模型组大鼠心肌纤维排列紊乱、肿胀，心肌组织间质有大量炎性细胞浸润，且可见部分心肌细胞坏死；EPCs组大鼠心肌纤维排列较模型组整齐，心肌细胞坏死程度减轻；中药组大鼠心肌纤维排列较EPCs组整齐，可见少量炎性细胞浸润；联合组大鼠心肌纤维排列较整齐，炎性细胞浸润较EPCs组及中药组有所改善；阻断剂组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌纤维肿胀及炎性细胞浸润较明显，并可见部分心肌细胞变性及坏死。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织形态（HE染色，×400）

2.4 丹参通络解毒汤和内皮祖细胞对模型大鼠心肌组织p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，EPCs组、中药组、联合组及阻断剂组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与EPCs组比较，中药组及联合组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01），阻断剂组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与中药组比较，联合组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显升高（P＜0.01），阻断剂组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与联合组比较，阻断剂组大鼠心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显降低（P＜0.01）。见表2、图3。

表2 各组大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较（±s）

注：与假手术组相比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与EPCs组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与中药组比较，▲▲P＜0.01；与联合组比较，★★P＜0.01

组别 只数 p-PI3K/GAPDH p-Akt/GAPDH假手术组 10 0.66±0.04 0.04±0.02模型组 10 0.89±0.04** 0.09±0.02**EPCs组 10 1.01±0.02## 0.17±0.02##中药组 10 1.05±0.03##△ 0.20±0.02##△联合组 10 1.20±0.03##△△▲▲ 0.25±0.03##△△▲▲阻断剂组 10 0.92±0.04#△△▲▲★★ 0.12±0.03#△△▲▲★★

图3 各组大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印迹图

3 讨论

目前临床对AMI多采用介入、抗凝治疗，但无法调节梗死后心肌的再生和修复能力，因此效果并不理想。EPCs是骨髓和外周血的干细胞，具有较强的促血管生成和修复血管内皮功能[11]。中药可通过调控EPCs促进心血管疾病恢复。研究发现，黄芪甲苷能改善体外培养的人EPCs生物学功能，具有调节EPCs介导的血管新生潜能[12]，黄芪多糖可通过上调血管内皮生长因子（VEGF）及相关受体的表达保护EPCs[13]。本研究发现，EPCs组较模型组心肌纤维排列整齐，心肌细胞坏死程度减轻，LVDP、LVSP、LVEF明显升高（P＜0.01），提示EPCs移植可改善MIRI病理形态，提高心功能，保护心肌组织。EPCs联合丹参通络解毒汤灌胃治疗后，大鼠心肌纤维较单用EPCs或丹参通络解毒汤排列整齐，心功能明显改善，差异有统计学意义（P＜0.01），表明丹参通络解毒汤能促进EPCs改善MIRI病理形态及心功能，保护心肌组织。

PI3K/Akt信号通路是再灌注损伤补救激酶信号通路之一，在MIRI中有重要作用。PI3K可被细胞外信号通路受体激活，活化的PI3K以磷酸化形式存在，可进一步激活二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3可将细胞外信号传导至下游Akt，p-Akt具有保护MIRI的作用[14]。马阳等[15]研究表明，Id-1和E2-2协同对PI3K/Akt信号通路起调控作用，进而影响EPCs的增殖。吴海卫等[16]研究发现，促红细胞生成素能降低EPCs凋亡率，其作用依赖PI3K/Akt信号通路。本研究结果显示，EPCs联合丹参通络解毒汤灌胃治疗后，大鼠心肌组织p-PI3K、p-Akt蛋白表达较单用EPCs或丹参通络解毒汤明显升高（P＜0.01），采用PI3K阻断剂后，p-PI3K和p-Akt蛋白表达明显降低（P＜0.01），提示丹参通络解毒汤可促进EPCs保护心肌组织，可能与调节PI3K/Akt信号通路有关。

MIRI可归属中医学“胸痹”“心悸”等范畴。火、毒、瘀在胸痹发病中有重要作用，火热积聚成毒，损伤心营，灼伤血脉，日久成瘀，导致“火”“毒”“瘀”积聚于心脉，引发胸痹[17]。MIRI从血瘀向毒证转化时，增加了急性心血管事件的发生，治疗当用活血解毒法[18]。丹参通络解毒汤由丹参、玄参、当归、黄连、栀子、黄芪组成，具有活血通络、清营解毒、益气养阴功效。本实验虽未完全阐明丹参通络解毒汤促进EPCs保护MIRI的作用机制，但结果提示，该方干预EPCs保护MIRI具有优势互补、协同增效的特点，推测该方还可能在EPCs动员、归巢、增殖和分化中起多靶点、多效应的调节作用，有待今后进一步研究。

综上，丹参通络解毒汤联合EPCs移植可显著保护MIRI，其机制可能与调控PI3K/Akt信号通路有关。本研究结果可为中医药干预干细胞移植、防治AMI提供实验依据。