电针对肝郁脾虚型慢性疲劳综合征大鼠血清炎症因子及肠道菌群的影响

谢亚娜，嵇波，张琴，牟秋杰，赵国祯，刘翼天，石天宇，徐塽，韩娜娜，刘玉婷，张靖宇，葛云鹏

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

慢性疲劳综合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一种多系统功能障碍性疾病，以显著而持久的疲劳为主要特征，伴运动能力下降、认知障碍、焦虑、抑郁等表现[1-2]。据统计，全球CFS患病率为0.89%[3]，中国CFS患病率为12.21%[4]。CFS存在严重致残性，可致27%CFS患者完全丧失劳动能力，35%～69%CFS患者无法正常工作[1，5]。目前，针对CFS的西医药物和运动治疗均存在作用局限、不良反应常见、安全性未知等问题[6-7]。研究表明，电针治疗能有效改善CFS患者的疲劳症状、认知功能、焦虑和抑郁情绪，提高CFS患者生存质量并有良好的安全性[8-10]。

CFS的发生与机体免疫炎性反应密切相关[11]。已有研究发现，CFS患者血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）过表达[11-13]，细菌内毒素成分脂多糖释放增加[13-14]，肠道菌群厚壁菌门、变形菌门等丰度改变[14]。TNF-α是介导免疫炎性反应的重要因子[15]，脂多糖是免疫信号的强力激活剂[16]，肠道菌群可调节免疫功能，参与炎性反应发生[17]。本实验通过观察电针“足三里”“合谷”“太冲”对肝郁脾虚型CFS模型大鼠行为学、血清TNF-α和脂多糖水平及肠道菌群门丰度的影响，探讨“足三里”“合谷”“太冲”配穴对肝郁脾虚型CFS的治疗效应及可能的调节机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级雄性SD大鼠18只，10周龄，体质量（375±25）g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（浙）2019-0001。饲养于北京中医药大学动物实验中心，室温（24±1）℃，相对湿度50%～60%，12 h昼夜节律，自由饮食进水，适应性喂养1周。将大鼠随机分为对照组、模型组和电针组，每组6只。本实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（BUCM-4-2019090101-3041）。实验过程中对动物的处理严格遵循2006年中华人民共和国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2 主要试剂与仪器

乌来糖（上海国药试剂集团，批号20180308），琼脂糖（美国Bio-rad公司，批号1613102），大鼠脂多糖、TNF-α酶联免疫吸附法检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号分别为m1856951-J、m1002859-J），磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，货号DP712），TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒（美国Illumina公司）。0.20 mm×13 mm华佗牌一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），二导HAN’S穴位刺激仪（北京华卫产业开发有限公司，型号LH202H），动物行为轨迹分析系统（美国Plexon公司，型号CinePlex），动物行为学采集分析软件（荷兰NOLDUS公司，型号EthoVision XT），酶标仪（美国Molecular Devices公司，型号Spectra MAX M2），PCR仪（美国Bio-rad公司，型号Bio-rad T100），蓝色荧光定量系统（美国Promega公司，型号QuantiFluorTM-ST），荧光仪（美国Thermo Fisher公司，型号Qubit 2.0），生物分析仪（美国Agilent公司，型号2100），高通量测序平台（美国Illumina公司，型号NovaSeq 6000）。

1.3 造模

参照文献[18-19]并改进，采用强迫游泳、慢性束缚和饮食控制方法制备肝郁脾虚型CFS大鼠模型。大鼠每日于水深45 cm、水温（26±1）℃圆桶内强迫游泳15 min，束缚袋束缚3 h，2种应激方法随机交替施加，避免产生适应性，同时饮食控制（单日进食、双日禁食），持续造模21 d。以大鼠萎靡嗜卧、食欲减退、易激惹、便溏伴造模后负重力竭游泳、矿场实验和高架十字迷宫表现明显削弱为模型成功标准。

1.4 干预

造模同时进行电针治疗。参照《实验针灸学》[20]选取大鼠双侧“足三里”“合谷”“太冲”。“太冲”“合谷”直刺约2 mm，“太冲”连接电针负极，“合谷”连接电针正极；“足三里”直刺约7 mm，连接电针负极，并于“足三里”下2 mm处浅刺入皮下，连接电针正极。频率2 Hz/15 Hz，强度1 mA，每次20 min，每日1次，共21 d。对照组和模型组给予同等条件束缚。

1.5 指标检测

1.5.1 旷场实验

第22日，将大鼠放置在开阔箱中央，箱上方安置摄像机，摄像机与计算机相连，记录分析大鼠在箱内3 min移动总路程和平均速度，以此评估大鼠在陌生环境中自发运动能力。

1.5.2 高架十字迷宫实验

第22日，将大鼠面向开放臂放置在十字迷宫中央格内，记录5 min内大鼠开放臂进入次数和停留时间，以此评估大鼠焦虑样表现。

1.5.3 负重力竭游泳

第23日，将大鼠置于水深45 cm、水温（26±1）℃圆桶内进行负重游泳，使用秒表记录力竭游泳时间，以此评估大鼠体力和疲劳情况。大鼠负重标准：体质量5%～10%；力竭判断标准：头部沉入水下10 s，不能上浮。

1.5.4 肿瘤坏死因子-α和脂多糖含量检测

行为学实验结束后，20%乌拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 500 r/min离心15 min，取上层血清进行ELISA检测，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.5.5 16S rDNA测序

大鼠麻醉取血，取结肠新鲜内容物置于无菌冻存管，-80 ℃冰箱保存。检测时对样本基因组DNA进行提取、稀释，使用带Barcode特异引物扩增目标区域16S V3～V4区（341F-806R），上游341F 5’-CCTAY GGGRBGCASCAG-3’，下游806R 5’-GGACTACNN GGGTATCTAAT-3’，PCR扩增、定量检测及纯化，将纯化的扩增产物等量混合，连接测序接头，使用建库试剂盒进行文库构建，经Qubit定量和Agilent质检合格后，使用NovaSeq 6000进行上机测序形成OTU，基于OTU的绝对丰度进一步获得各组肠道菌群门分类水平上各物种的相对丰度，以百分比表示。

1.6 统计学方法

采用SAS9.4统计软件进行分析，Graphpad Prism 8.4.0软件绘制统计图。计量资料以±s表示，满足正态分布且方差齐时用方差分析，两两比较用LSD法，方差不齐用Welch检验；非正态分布用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对模型大鼠自发运动能力的影响

与对照组比较，模型组大鼠旷场活动总路程和平均速度明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠旷场活动总路程和平均速度明显增加（P＜0.01）。见图1。

图1 各组大鼠旷场实验结果比较（±s，每组6只）

2.2电针对模型大鼠焦虑样表现的影响

与对照组比较，模型组大鼠开放臂进入次数和停留时间均明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠开放臂进入次数和停留时间均明显增加（P＜0.01）。见图2。

图2 各组大鼠高架十字迷宫实验结果比较（±s，每组6只）

2.3 电针对模型大鼠负重力竭游泳时间的影响

与对照组比较，模型组大鼠负重力竭游泳时间明显缩短（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠负重力竭游泳时间明显延长（P＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠负重力竭游泳时间比较（±s，每组6只）

2.4 电针对模型大鼠血清肿瘤坏死因子-α、脂多糖含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，电针组大鼠血清TNF-α、脂多糖含量减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠血清TNF-α、脂多糖含量比较（±s，每组6只）

2.5 电针对模型大鼠肠道菌群门水平丰度的影响

在门分类水平上，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、螺旋体门和放线菌门是主要优势菌群。与对照组比较，模型组大鼠肠道厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门丰度下降，变形菌门和螺旋体门丰度升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，电针组大鼠肠道厚壁菌门和放线菌门丰度升高，变形菌门和螺旋体门丰度下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3 讨论

根据临床表现，CFS可归属中医学“虚劳”“郁证”等范畴，病位多涉及肝、脾两脏，临床常见肝郁脾虚证型[21-22]。《素问·痿论篇》有“肝主身之筋膜，脾主身之肌肉”，强调肝脾与人的精神情志和肌肉筋膜运动密切相关，而精神情志、肌肉筋膜运动变化与CFS临床症状的发生发展联系紧密[23]。《通玄指要赋》言“三里却五劳之羸瘦”，认为足三里能补中益气，改善疲劳。《针灸穴名解》有“合谷、太冲各两穴，名为四关，以其能大开通也”，认为合谷、太冲同用能调治气血、疏理气机，是解郁安神要穴。研究发现，针刺“足三里”“合谷”“太冲”可健脾解郁、扶正培元，显著改善CFS模型小鼠的心理及躯体疲劳症状[24]。因此，本实验选用电针“足三里”“合谷”“太冲”三穴。

本实验通过模拟人类生活中生理及心理应激、饮食不节现象，建立肝郁脾虚型CFS大鼠模型。结合行为学实验及模型组大鼠随着造模推进出现的倦怠、嗜卧、食欲减退、大便稀溏、易激惹等表现，与临床上肝郁脾虚型CFS患者表现出的乏力、气短神疲、急躁易怒、紧张焦虑、纳呆、便溏等症状较为接近，提示造模有效。

负重力竭游泳时间是反映大鼠体力状态的经典指标，用以评价大鼠的疲劳情况。本实验结果表明，模型组大鼠负重力竭游泳时间明显缩短，表现为体力下降、易疲劳。电针组大鼠负重力竭游泳时间明显延长，提示电针“足三里”“合谷”“太冲”能增强CFS大鼠体力并改善疲劳。旷场实验是反映大鼠在陌生环境中自发活动行为的经典实验方法，用以评估大鼠运动能力。本实验发现，模型组大鼠旷场活动总路程和平均速度明显减少，表现为运动能力下降，与临床上CFS患者的运动能力降低相一致[2]。电针组大鼠旷场活动总路程和平均速度明显增加，提示电针“足三里”“合谷”“太冲”能提高CFS大鼠的运动能力。高架十字迷宫是反映大鼠紧张情绪的经典行为学实验，用以评估大鼠的焦虑状态。模型组大鼠开放臂进入次数和停留时间减少，表现为明显焦虑。电针组大鼠开放臂进入次数和停留时间明显增加，提示电针“足三里”“合谷”“太冲”具有抗焦虑样作用。

免疫炎性反应是机体移除有害刺激，促进损伤修复的保护性措施，应答过度可导致机体细胞、器官等功能受损，介导疾病产生。研究发现，CFS患者免疫系统功能发生紊乱，血液中多种细胞因子水平失衡[12]。TNF-α是免疫系统中重要的促炎细胞因子，可诱导细胞凋亡，参与炎性反应的病理过程[15]。TNF-α过表达可降低机体免疫功能，促使炎性介质或其他细胞因子爆发式增长，加剧机体炎性反应，导致多系统功能损伤[25-26]。研究发现，TNF-α过表达与脂多糖介导的免疫激活密切相关[13，16，27]。脂多糖存在于革兰阴性菌外膜中，是一种炎性反应诱导剂[16，28]。根据促炎效力，脂多糖可分为激动性、弱激动性和拮抗性三类，其中激动性脂多糖的释放与变形菌门变化相关，可以刺激免疫细胞活化，上调TNF-α表达[13，16，27，29-30]。研究显示，TNF-α与脂多糖共同参与CFS患者体内免疫炎性反应，二者含量递增与CFS患者临床症状（疲劳、情志改变等）变化紧密相关[11-13]。本实验结果表明，模型组大鼠血清TNF-α、脂多糖含量增加，与既往研究一致[11-14]。电针后，大鼠血清TNF-α、脂多糖含量减少，提示电针“足三里”“合谷”“太冲”改善肝郁脾虚型CFS模型大鼠症状是通过下调大鼠血清TNF-α、脂多糖水平，抑制炎性反应发挥作用。

肠道内菌群水平改变可影响机体免疫器官发育或介导机体炎性反应发生，从而影响宿主健康。CFS患者肠道菌群厚壁菌门丰度下降，变形菌门丰度升高，这种改变可能与CFS患者肠道内促炎性物种增加，抗炎性物种减少相关[14]。本实验中，模型组大鼠肠道厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门丰度下降，变形菌门和螺旋体门丰度升高，与既往研究变化趋势相似[14]；电针组大鼠厚壁菌门和放线菌门丰度升高，变形菌门和螺旋体门丰度下降。由于3组间门水平物种丰度变化差异无统计学意义，故尚不能认为电针“足三里”“合谷”“太冲”改善肝郁脾虚型CFS大鼠症状是通过调节肠道菌群门水平丰度变化发挥作用的。

综上所述，电针“足三里”“合谷”“太冲”能增强肝郁脾虚型CFS大鼠运动能力，改善疲劳状态和焦虑情绪，其机制可能与下调血清TNF-α及脂多糖水平、抑制炎性反应有关，但尚不能认为与调节肠道菌群门水平丰度相关。今后可深化肠道菌群种属和代谢水平的研究，以期挖掘肠道菌群免疫介导作用与CFS之间的关系。