敦煌医学古方大补脾汤对放射性肺损伤大鼠PI3K/Akt信号通路的影响

张朝宁，余臣祖

甘肃中医药大学，敦煌医学与转化教育部重点实验室，甘肃 兰州 730000

放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗不可避免的并发症，包括放射性肺炎和放射性肺纤维化，发生率约为25%，不仅是限制放疗的主要因素，还严重影响患者生活质量[1-2]。放射性肺损伤发生机制尚不明确，目前临床无理想防治药物，若不能尽早控制疾病进展，将会出现不可逆转的放射性肺纤维化，最终导致患者呼吸衰竭甚至死亡[3]。研究表明，PI3K/Akt信号通路参与放射性肺损伤的发生，抑制Akt磷酸化，可抑制胶原蛋白沉积，减轻肺纤维化[4-6]。课题组前期研究发现，敦煌医学古方大补脾汤可改善放射性肺损伤大鼠肺部病理损害，抑制多种与放射性肺损伤密切相关的细胞因子表达[7]，但是否与PI3K/Akt信号通路有关尚待研究。基于此，本实验通过X射线照射大鼠右肺建立放射性肺损伤大鼠模型，观察大补脾汤对模型大鼠PI3K/Akt信号通路的影响，进一步探讨大补脾汤治疗放射性肺损伤的作用机制，为敦煌医学古方的推广应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠40只，2～3月龄，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SYXK（甘）2015-0003。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 药物及制备

大补脾汤（人参、炙甘草、干姜各15 g，白术、麦冬、五味子、旋覆花各5 g），饮片购自甘肃中医药大学附属医院中药房，甘肃中医药大学中药制药实验室煎制，浓缩至含原药材1.214 g /mL，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号分别为ml003142、ml160611、ml038288、ml337631），免疫组化多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，货号PC0020），DAB试剂盒、抗体稀释液、免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号分别为ZLI-9018、ZLI-9028、SP9003），兔抗PI3K、Akt、p-Akt抗体（美国GeneTex，货号分别为GTX111068、GTX121937、GTX128414），兔抗p-PI3K抗体（英国Abcam，货号ab182651），反转录试剂盒、SYBR Fast qPCR试剂盒（上海翌圣，货号分别为10606ES60、H4901030）。X射线辐射仪（美国Faxitron，型号RX650），实时定量PCR仪（美国Thermo，型号StepOne Plus），高速低温台式离心机（德国Eppendorf，型号TGL-16），PRO200型组织匀浆器（美国Bio-Gen公司），M-2016型石蜡切片机、TEC-VEM-J2型石蜡包埋机、VIP-5JR-J2型自动组织脱水机（德国Leica公司），恒温培养箱（青岛澳柯玛股份有限公司，型号BC/BD-208HNE），电泳仪（北京六一生物，型号DYY-6D），摇床（德国IKA，型号SK-O180-E），酶标仪（美国Bio-Rad，型号iMark）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

采用随机数字表法将40只SD大鼠分为空白对照组、模型组、单次给药组、两次给药组，每组10只。照射前单次给药组、两次给药组每日予大补脾汤灌胃（按人与大鼠体表面积折算，大鼠每日给药量约为成人的10倍，即12.14 g/kg），空白对照组和模型组每日予等量生理盐水灌胃，连续2周。照射后，两次给药组每日继续予大补脾汤灌胃2周（剂量同前），其余各组予等量生理盐水灌胃，给药体积均为2.6 mL。

2.2 造模

参考前期研究中放射性肺损伤大鼠模型制备方法[7]，照射前10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，除空白对照组外，其余各组大鼠用X射线辐射仪单次照射右肺，铅皮屏蔽身体其余部位。1 Gy/min，吸收剂量为8 Gy。

2.3 标本采集

照射后2周颈椎脱臼法处死大鼠，腹主动脉取血，12 000 r/min离心15 min，分离血清，按ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt含量。分离大鼠右肺，冰生理盐水冲洗，分装放入冻存管，-80 ℃冰箱冻存。行免疫组化检测的右肺组织用4%多聚甲醛固定。

2.4 免疫组化检测大鼠右肺组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达

取大鼠右肺组织，常规石蜡包埋、切片（厚度4 μm），经脱蜡、水化、修复后，封闭加PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗体，显色、脱水、封片。用Olympus光学显微镜读片拍照，BI-2000免疫组化分析软件计算图片平均灰度值，蛋白相对表达量用平均灰度值表示，灰度值越大，蛋白表达量越低。

2.5 qPCR检测大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达

取大鼠右肺组织，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，进行qPCR。反应体系：SYBR Fast qPCR Mix（2×）10 μL，引物2 μL，cDNA 2 μL，加灭菌蒸馏水至20 μL；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40次循环。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，并在GeneBank上核对证实，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot检测大鼠右肺组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达

取200 mg大鼠右肺组织，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白变性后，经SDS-PAGE、转膜、免疫杂交反应，最后曝光显影观察，采用Image J 6.0对条带量化分析，以目的蛋白条带与内参条带灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，方差不齐用Dunnett’s检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 大补脾汤对模型大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，单次给药组、两次给药组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明显减少（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 PI3K/（pg/mL） Akt/（μmol/L） p-PI3K/（pg/mL） p-Akt/（μmol/L）空白对照组 10 806.55±13.86 23.95±0.79 815.79±30.96 11.85±0.51模型组 10 881.55±15.31** 28.18±0.57** 942.98±49.00** 13.41±0.52**单次给药组 10 829.17± 9.92# 25.29±0.86# 873.25±48.13# 12.53±0.55#两次给药组 10 795.04±16.82## 24.67±0.53## 829.39±40.03## 11.55±0.53##

4.2 大补脾汤对模型大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt阳性表达的影响

免疫组化结果显示，PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt在正常大鼠肺组织中表达较少，经X射线照射后，在支气管黏膜周围表达增强，单次给药组阳性表达减弱，两次给药组阳性表达减弱更为明显。与空白对照组比较，模型组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，单次给药组、两次给药组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3、图1。

图1 各组大鼠右肺组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt阳性表达（免疫组化染色，×40）

表3 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt阳性表达比较（±s，平均灰度值）

表3 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt阳性表达比较（±s，平均灰度值）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 PI3K Akt p-PI3K p-Akt空白对照组 10 0.35±0.03 0.30±0.02 0.34±0.02 0.33±0.03模型组 10 0.21±0.02** 0.20±0.02** 0.22±0.02** 0.22±0.03**单次给药组 10 0.29±0.02# 0.25±0.03# 0.29±0.02# 0.25±0.03#两次给药组 10 0.24±0.01## 0.21±0.02## 0.24±0.03## 0.22±0.04##

4.3 大补脾汤对模型大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，单次给药组、两次给药组大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达比较（±s）

表4 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt mRNA表达比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 PI3K Akt空白对照组 10 1.00±0.05 1.00±0.06模型组 10 1.72±0.09** 1.75±0.14**单次给药组 10 1.46±0.03# 1.20±0.04#两次给药组 10 1.10±0.05## 1.10±0.08##

4.4 大补脾汤对模型大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，单次给药组、两次给药组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表5、图2。

表5 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达比较（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 只数 PI3K Akt 空白对照组 10 1.00±0.08 1.00±0.03 模型组 10 1.87±0.21** 1.92±0.06** 单次给药组 10 1.46±0.16# 1.40±0.06# 两次给药组 10 0.85±0.07## 0.93±0.04## p-PI3K p-Akt1.00±0.08 1.00±0.08 1.44±0.02** 1.82±0.16**1.20±0.11# 1.50±0.15#0.95±0.08## 1.17±0.10##

图2 各组大鼠右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印迹图

5 讨论

当肺组织遭受电离辐射时，会引起肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤或凋亡，诱导单核细胞、淋巴细胞和粒细胞发生一系列炎症反应和趋化，聚集在组织损伤部位，进而导致大量炎症因子、趋化因子和生长因子释放，当这种损害持续时，最终会导致肺纤维化[8-9]。

PI3K/Akt信号通路参与肺组织损伤，在体外循环相关肺损伤大鼠模型中，PI3K/Akt信号通路通过介导细胞凋亡发挥作用[10-11]。PI3K存在于细胞中，通过磷酸化细胞膜上的家族成员，募集和激活下游一系列靶分子（如Akt），Akt是PI3K下游的重要激酶之一，Akt被活化后会参与中性粒细胞凋亡，通过调控Akt活性可抑制肺组织炎症反应[12-13]。

此外，PI3K/Akt通路是介导肺纤维化的重要信号通路。Tsoyi等[14]发现，通过调控PI3K/Akt信号通路可抑制成纤维细胞激活，减轻放射线诱导的肺纤维化。脂多糖通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制自噬，促进肺成纤维细胞增殖，进而促进肺纤维化[15]。彭文潘等[16]发现，PI3K/Akt信号通路是陈皮治疗肺纤维化的潜在作用通路之一。饶鸿宇等[17]通过网络药理学研究发现，补肺活血胶囊通过PI3K/Akt等关键信号通路缓解患者肺纤维化程度。因而，PI3K/Akt信号通路可作为防治放射性肺损伤的作用靶点之一。

大补脾汤出自敦煌医学卷子《辅行诀脏腑用药法要》，主治脾气大疲，饮食不消，时自吐利，其人枯瘦如柴，立不可动转，口中苦，干渴，汗出，气急，脉微而时结者。方中人参益气生津，炙甘草、白术健脾益气，干姜温中散寒，麦冬益胃生津，五味子敛肺生津，旋覆花降逆止呕。诸药合用，共奏益气生津、补脾益肺之功。

肺属金，脾属土，脾为肺之母脏，培土生金法是根据“虚则补其母”原则，通过补益脾气而达到补益肺气。大补脾汤切合胸部恶性肿瘤放疗患者因射线导致的肺脾气阴亏虚之病机特点，是培土生金理论的具体体现。本研究结果显示，大鼠右肺受8 Gy X射线照射后，与空白对照组比较，模型组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明显增加（P＜0.01），右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表达显著上调（P＜0.01），表明PI3K/Akt信号通路表达异常，参与介导了放射性肺损伤的发生。与模型组比较，单次给药组和两次给药组大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明显减少（P＜0.05，P＜0.01），右肺组织PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01），表明大补脾汤可抑制PI3K、Akt磷酸化，调控PI3K/Akt信号通路，从而发挥对放射性肺损伤大鼠的保护作用。其中，两次给药组大鼠各项指标变化更明显，说明照射前和照射后两次给药疗效最佳。

综上所述，PI3K/Akt信号通路参与介导了放射性肺损伤的发生，大补脾汤通过抑制PI3K、Akt磷酸化，调控PI3K/Akt信号通路，发挥对放射性肺损伤的保护作用。