益胃消瘀颗粒质量标准研究

时间：2024-05-14

刘霞　徐冲　吴文辉　郭小红　孙全　田锋亮

摘要：目的建立益胃消瘀颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法（TLC）定性鉴别白术、当归和石斛，采用HPLC同时测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及人参皂苷Re的含量。结果 TLC斑点清晰，阴性对照无干扰。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re分别在0.067 2～0.672 ?g（r=0.999 6）、0.501 2～5.012 ?g（r=0.999 6）、0.326 5～3.265 ?g（r=0.999 6）、0.098 3～0.983 ?g（r=0.999 7）范围内线性关系良好，平均回收率分别为96.32%、96.45%、101.23%、97.89%，RSD分别为1.3%、1.5%、1.7%、1.7%。结论该方法准确可靠，重复性好，可用于益胃消瘀颗粒的质量控制。

关键词：益胃消瘀颗粒；质量标准；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；人参皂苷Re

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.017

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0077-04

Abstract： Objective To establish the quality standard for Yiwei Xiaoyu Granules. Methods TLC was used for the qualitative analyses of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma， Angelicae Sinensis Radix and Dendrobii Caulis； HPLC was applied to determine the contents of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re. Results The TLC spots were clear and free from negative interference. Notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1， ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re showed good linear relationships within the ranges of 0.067 2–0.672 ?g （r=0.999 6）， 0.501 2–5.012 ?g （r=0.999 6）， 0.326 5–3.265 ?g （r=0.999 6）， 0.098 3–0.983 ?g （r=0.999 7）， whose average recoveries were 96.32% （RSD=1.3%）， 96.45% （RSD=1.5%）， 101.23% （RSD=1.7%）， and 97.89% （RSD=1.7%）， respectively. Conclusion This method is accurate， reliable， and reproducible， which can be used for the quality control of Yiwei Xiaoyu Granules.

Keywords： Yiwei Xiaoyu Granules； quality standard； notoginsenoside R1； ginsenoside Rg1； ginsenoside Rb1； ginsenoside Re

益胃消瘀顆粒由红参、三七、娑罗子、白术、当归、石斛等10味中药组成，具有温脾益气养阴、疏肝和胃化瘀功效，临床主要用于治疗胃脘痞满、胃中嘈杂或隐痛、食纳减少等脾阳胃阴不足、气滞夹瘀证的慢性浅表性胃炎及萎缩性胃炎伴有肠上皮化生、异型增生者[1]。该方原以汤剂形式在本院应用10余年，临床疗效确切且安全可靠，现拟将汤剂改成颗粒剂，以更好地适应患者需求。

本课题组前期已建立了益胃消瘀颗粒的制备工艺：红参、三七粉碎成细粉，过筛，其余娑罗子等8味药加水煎煮，煎液过滤，合并滤液，浓缩至适量，与上述粉末混匀，干燥，粉碎成细粉，加糊精适量，制成颗粒，干燥，混匀，包装，即得。为了更好地控制益胃消瘀颗粒的质量，保证临床用药安全有效，需建立益胃消瘀颗粒的质量标准。方中红参、三七共为君药，以粉末形式加入制粒，2015年版《中华人民共和国药典》（一部）以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re为指标性成分对红参进行定量评价，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1为指标性成分对三七进行定量评价，故本研究采用HPLC同时测定益胃消瘀颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re多指标性成分，采用TLC对方中白术、当归、石斛进行定性鉴别，控制益胃消瘀颗粒的质量。

1 仪器与试药

Agillent-1260高效液相色谱仪（美国Agillent公司），SymmetryShieldTM RP18色谱柱（5 ?m，250 mm×4.6 mm），KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），JA3003J型电子密度天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），AE-200型电子天平（天津METTLER公司），智能恒温电热套（ZNHW-Ⅱ型，河南爱博特公司）。

益胃消瘀颗粒（批号160321、160322、160323），重庆市中医院制剂室提供。阿魏酸、石斛酚、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品（批号分别为110773-201313、111875-201202、0745-200006、0703-200118、110704-201124、754-200115），白术对照药材（批号0925-200005），中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 白术

取样品（批号160321、160322、160323）10 g，加水煎煮2 h，过滤，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按处方称取除白术外的药材，按制剂工艺制得缺白术阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。吸取上述5种溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

2.1.2 当归

取样品（批号160321、160322、160323）10 g，加1%碳酸氢钠溶液50 mL，超声处理10 min，离心，取上清液，用稀盐酸调节pH值至2?3，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇l mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材1 g，加1%碳酸氢钠溶液50 mL，同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每l mL含l mg的溶液，作为对照品溶液。按处方称取除当归外的药材，按制剂工艺制得缺当归阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。吸取上述6种溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-甲醇-冰醋酸（10∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

2.1.3 石斛

取样品（批号160321、160322、160323）10 g，加甲醇50 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取石斛酚对照品，加三氯甲烷制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方称取除石斛外的药材，按制剂工艺制得缺石斛阴性制剂，同法制成阴性对照溶液。吸取上述5种溶液各10 ?L，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）為展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Waters C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～25 min，81%B；25～50 min，81%→79%B；50～55 min，79%→69%B；55～80 min，69%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 ?L。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re对照品适量，用甲醇配制成浓度分别为0.067 2、0.501 2、0.326 5、0.098 3 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取本品约15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）1 h，放冷，再称定质量，用水饱和正丁醇溶液补足减失的质量，过滤，精密量取续滤液25 mL，置分液漏斗中，加氨试液洗涤2次，每次15 mL，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

按处方量并以相同制剂工艺制备缺红参和三七的阴性样品，称取约15 g，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.2.5 系统适用性试验

取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果所测成分色谱峰与样品中其他组分色谱峰基线分离，阴性无干扰，见图1。

2.2.6 线性关系考察

精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、4、8、10 ?L，按“2.2.1”项下条件测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得各成分回归方程。三七皂苷R1：Y=278.810 5X-1.185 6（r=0.999 6）；人参皂苷Rg1：Y=188.312 6X+1.385 2（r=0.999 6）；人参皂苷Rb1：Y=243.501 8X+0.715 1（r=0.999 6）；人参皂苷Re：Y=207.456 5X+2.385 7（r=0.999 7）。4种成分依次在0.067 2～0.672 ?g、0.501 2～5.012 ?g、0.326 5～3.265 ?g、0.098 3～0.983 ?g范围内线性关系良好。

2.2.7 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液5 ?L，重复进样6次，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的RSD分别为1.6%、1.4%、1.5%、0.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验

称取同一批益胃消瘀颗粒6份，每份约15 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的RSD分别为1.7%、1.2%、1.0%、1.5%，表明本方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验

称取益胃消瘀颗粒约15 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12 h按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re的RSD分别为1.8%、1.0%、0.9%、1.3%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.2.10 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号160321）1.0 g，共24份，分别精密加入“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，同时按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1，表明本方法回收率良好。

2.2.11 样品含量测定

取3批样品，按上述方法测定，结果见表2。

3 讨论

白术的化学成分主要为挥发油，对白术及其制剂的TLC鉴别主要是对其挥发油类成分的鉴别[2]103。目前益胃消瘀颗粒的制备工艺沿用传统方法，通过水煎煮制成颗粒剂，故需对白术的水溶性成分进行鉴别。本试验曾分别采用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.2）、三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）展开系统[3-4]，结果表明，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（9.5∶0.5∶0.5）为展开剂，紫外光365 nm波长下检视，样品斑点清晰，分离效果较好。

当归的主要化学成分包括挥发油和水溶性成分，其中阿魏酸是当归水溶性部分主要有效成分之一。本试验分别考察了苯-甲醇-冰醋酸（10∶1∶0.5）、正己烷-三氯甲烷-冰醋酸（6∶4∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶1∶1）展开系统[2]133[5-6]，发现以苯-甲醇-甲酸（10∶1∶0.5）为展开系统时分离度高，斑点清晰。

经本院药检室鉴定，益胃消瘀颗粒所使用的石斛为黄草石斛。对其TLC鉴别，试用2015年版《中华人民共和国药典》（一部）石斛项下流苏石斛等薄层色谱鉴别方法，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（3∶2）为展开剂，但供试品展开效果不理想，虽然显色后可见石斛酚的斑点，但斑点不够圆整。故又分别考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）、环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（1∶2∶3）展开系统[2]92[7]。结果表明，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（12∶6∶1）为展开剂时，阴性无干扰，斑点圆整清晰，分离度较好。

益胃消瘀颗粒处方中，三七和红参共为君药，药理研究表明，红参的主要有效成分人参皂苷类具有抑制胃癌细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用[8-10]，三七及其主要有效成分三七皂苷R1能在一定程度上减轻胃缺血-再灌注黏膜损伤，且三七能逆转大鼠胃黏膜上皮异型增生和肠上皮化生等[11-13]，故本试验选择三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re作为益胃消瘀颗粒含量测定指标。在Waters C18色谱柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（0～25 min，81%B；25～50 min，81%→79%B；50～55 min，79%→69%B；55～80 min，69%B），203 nm波长条件下，4个指标成分分离度良好，且阴性对照未见干扰。在甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时，峰2和峰3不易分离，且柱压相对较高。

综上所述，本试验所建立的白术、当归、石斛的TLC特征斑点清晰，阴性样品溶液均无干扰，且分离度好；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Re的HPLC含量测定方法可靠易行，专属性好，可为益胃消瘀颗粒质量控制提供依据。

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